紫杉醇前药的合成及其对肿瘤细胞活性抑制的研究

单玲玲,高贵珍,曹稳根,段 红

宿州学院化学与生命科学院,安徽宿州，234000

紫杉醇最早是在20世纪60年代从大平洋红豆杉的树皮中提取得到的，作为一种新型微管稳定剂，被誉为20世纪抗肿瘤药物研究领域中最重大的突破。临床上紫杉醇已被用于治疗多种恶性肿瘤，如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头颈部恶性肿瘤和急性白血病[1]。但由于紫杉醇是一种天然的四环二萜类物质，结构复杂——有一个庞杂的环状结构及众多疏水性取代基，故在水中的溶解性不好，制约了紫杉醇的临床应用，因此，需要开发溶解性好的紫杉醇前药[2]。

氨基酸是机体组成的最基本物质，也是能量代谢的基础物质。在肿瘤细胞分裂生长过程中，呈现出对氨基酸的摄取量超过正常组织和细胞，因此，研究者将一些必需氨基酸作为抗肿瘤药物的载体和Linker，这样促进肿瘤细胞对药物的吸收和摄取，同时也可改善化学药物的水溶性，提高药物的生物利用度[3]。在抗肿瘤药物研究中，如何利用氨基酸改造药物成为研究热点[3]。在众多氨基酸中，谷氨酸是药物改造的首选Linker，这是因为谷氨酸是机体必需氨基酸，主要参与机体的氮代谢和能量代谢。有研究证明，在肿瘤组织生长中，谷氨酸是关键性的氨基酸，肿瘤细胞对其摄取率远远高于正常组织，同时也高于其他任何一种氨基酸[4]。离体实验表明：乳腺癌细胞中谷氨酰胺合成酶mRNA表达水平显著增高[5]，合成的谷氨酸主要用于能量代谢。活体实验显示：肿瘤组织对谷氨酸的摄取量是正常组织的2倍[6]，因此，将谷氨酸作为化学药物的Linker，不仅可提高其水溶性，也可为合成高效低毒的前药提供新途径。

本课题旨在制备紫杉醇前药谷氨酸-紫杉醇，评价紫杉醇前药的理化性质、释药特征及药效，用荧光染料(FITC)标记谷氨酸-紫杉醇，从体外直观证明紫杉醇前药的药效特征，为寻求低毒、高效小分子改造紫杉醇提供科学的实验依据。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

紫杉醇(分析纯，江苏红豆杉药业有限公司)，谷氨酸(分析纯，美国Sigma公司)，荧光染料FITC(分析纯，美国sigma公司)；Model 580酶联免疫检测仪(美国Bio-Rad公司)，荧光倒置显微镜(德国Leica公司)。

1.2 紫杉醇-谷氨酸的合成

称取100 mg(0.117 mmol)PTX溶于15 mL的DCM，同时用59.7 mg(0.140 4 mmol)Fmoc-Glu(OtBu)OH和14.29 mg(0.117 mmol)催化剂DMAP，室温(19℃)搅拌22 h。待反应结束后，用同体积的DCM稀释，然后用同体积的蒸馏水洗2次，加入无水硫酸镁干燥，真空旋蒸后，即得晶状体产物Fmoc-Glu(OtBu)-PTX。脱去Fmoc得到紫杉醇-谷氨酸。

1.3 紫杉醇-谷氨酸-FITC的制备

将谷氨酸-紫杉醇溶于DMF中，加入0.01 mmol FITC,-4℃搅拌3 h，将反应液经G25纯化，得到纯化的紫杉醇-谷氨酸-FITC。

1.4 释药动力学观察

通过紫杉醇前药在不同溶液中酯键断裂的实验，观察紫杉醇前药在体外释药动力曲线的特征。

1.5 体外毒性和细胞摄取

1.5.1 细胞MTT实验

在96孔板的每个孔中，加入乳腺癌细胞(MDA-MB)和卵巢癌(SKOV3)，在37℃、二氧化碳浓度为5%的条件下，孵育48 h后，分别加入紫杉醇、紫杉醇-谷氨酸和紫杉醇-谷氨酸-FITC三种前药，紫杉醇的浓度为1 mg/mL。设空白组和对照组。感染48 h天后，在470 nm处的吸光值可用酶标仪进行测定。通过如下公式进行计算得到[7]：

Viable Rate(%)=(ODtreated/ODcontrol)×100%。

1.5.2 肿瘤细胞摄取前药的观察

通过体外细胞摄取实验，用FITC标记氨基酸-紫杉醇，考察乳腺癌细胞(MDA-MB-231)对紫杉醇前药的摄取，初步分析其靶向性的机理。

2 结果与讨论

2.1 谷氨酸-紫杉醇前药结构鉴定

纯化后的-NH2-Glu(OtBu)-PTX用LC-MS分析，其质谱鉴定结果(m/z=479 [M-1]-)也与-NH2-Glu(OtBu)-PTX的理论分子量完全一致，-NH2-Glu(OtBu)-PTX:MS(ESI,m/z):1283.4([M+Na]+)如图1。证明已成功合成谷氨酸-紫杉醇前药。

图1 谷氨酸-紫杉醇前药用LC-MS的结构鉴定

2.2 谷氨酸-紫杉醇前药释放曲线

图2 谷氨酸-紫杉醇前药

在三种不同溶液中释药动力学曲线

将Glu-PTX孵育在37℃的PBS、血浆和细胞培养液中，按照不同的时间点取100 uL样品。图2显示，在孵育4 h后，在PBS中Glu-PTX药物释放为15.8%，血浆中的释放率是26.3%，细胞培养液中孵育的释放率为37.8%。由图2可以看出,前药在PBS中释放速度最慢，在细胞培养液中释放速度最快，在血浆中的释放速度处于中间状态，这与细胞培养液和血浆中含酶有关。

2.3 谷氨酸-紫杉醇前药的细胞抑制率

用MTT法检测谷氨酸-紫杉醇前药对MDA-MB-231和SKOV3细胞的抑制活性，实验结果如图3。

从图3可以看出，药物对MDA-MB-231和SKOV3细胞的作用与药物的浓度有明显的依赖性，药物浓度越大对肿瘤细胞的抑制性越强。两种前药对肿瘤细胞的抑制性略低于PTX单体，表明利用2位羟基修饰PTX可降低其细胞毒性。药物对MDA-MB-231和SKOV3两种肿瘤细胞的抑制作用相比，药物对MDA-MB-231的抑制率高于SKOV3，说明紫杉醇和紫杉醇前药对MDA-MB-231肿瘤细胞的抑制作用优于对SKOV3的作用。

图3 紫杉醇前药在MDA-MB-231和SKOV3两种肿瘤细胞中的抑制作用(mean±SD,n=6)

2.4 紫杉醇前药在乳腺癌细胞中的摄取

用六孔板孵育MDA-MB-231细胞，加入FITC标记谷氨酸-紫杉醇前药并孵育12 h，由图4可观察到紫杉醇前药已进入肿瘤细胞，分析其结果，主要是因为紫杉醇前药提高了紫杉醇药物的水溶性，使肿瘤细胞对药物的摄取量增加。

图4 谷氨酸-紫杉醇前药在乳腺癌MDA-MB-231细胞中摄取

3 结 论

本实验成功制备了谷氨酸-紫杉醇前药，并用荧光染料标记紫杉醇前药，实验结果显示谷氨酸-紫杉醇前药具有良好的释药动力曲线，而对肿瘤细胞毒性较小，但可增加肿瘤细胞对其摄取量，这为改造紫杉醇提供了新途径。

参考文献：

[1]Wall ME.Camptothecin and taxol:discovery to clinic[J].Med Res Rev，1998，18(5):299-314

[2]Ettmayer P，Amidon G L，Clement B，et al.Lessons learned from marketed and investigational prodrugs[J].J Med Chem，2004,47：2393-2404

[3]卓仁喜，范昌烈，赵儒林.含5-氟尿嘧啶的氨基酸衍生物的合成及其抗肿瘤活性研究 [J].高等学校化学学报，2006,7(6)：508-512

[4]Abou-Khalil W H,Yunis A A,Abou-Khalil S.Prominent glutamine oxidation activity in mitochondria of hematopoietic tumors[J].Cancer Res,1983，43:1990-1993

[5]Sandra Loeppen,Daniela Schneider,Frank Gaunitz,et al.Overexpression of Glutamine Synthetase Is Associated with-Catenin-Mutations in Mouse Liver Tumors during Promotion of Hepatocarcinogenesis by Phenobarbital[J].Cancer Res,2002，62:5685-5688

[6]Landel A M,Hammond W G,Meguid M M.Aspects of amino acid and protein metabolism in cancer-bearing states[J].Cancer Res,1985,55:230-237

[7]Huang Y,Shi J,He Q,et al.The promise of paclitaxel-peptide conjugates for MMP-2-targeted drug delivery[J].Cancer Biol Ther,2010，9(3):204-205