罗源湾养殖大黄鱼虹彩病毒的PCR检测

杨小强 福州市海洋与渔业技术中心 福州 350026

大黄鱼是福建省最大的海水养殖鱼类，2011年产量达到8.6万t、产值60多亿元，年出口创汇近亿美元。我们常年对福建罗源湾网箱养殖大黄鱼开展病害监测工作，2009年开始发现高温期一种养殖户均称之为“白鳃病”的危害日趋严重，据不完全统计2011年罗源湾养殖大黄鱼因患“白鳃病”的病死率约30%。大黄鱼“白鳃病”主要流行于高温季节，主要症状表现为：患鱼水面游动缓慢，或漂浮于水面；体表完好，体色偏白，鳃丝呈贫血状态，发白；解剖发现脾、肾肿大；5～10 cm的幼鱼到成鱼均可发病。经流行病学检测未发现寄生虫、细菌和水质恶化、营养不良等致病因素，抗菌药物治疗无明显效果，存在病毒感染的可能。大黄鱼“白鳃病”发病症状与何爱华[1]、陈新华[2-3]等报道的大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)病症状相似，因此，本研究根据虹彩病毒特异性引物，应用PCR法对患鱼进行检测[4]，旨在初步诊断大黄鱼“白鳃病”的病原，为该病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品处理 2012年7～10月，从罗源湾收集网箱“白鳃病”症状明显的大黄鱼幼苗与养成鱼，经检测排除寄生虫、细菌感染。采集样品鳃丝、脾脏、肾脏、肝脏、性腺（成鱼），95%乙醇，-20℃保存，或置于离心管中，-86℃保存，备用。

1.2 试剂 北京百泰克公司细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型，用于快速提取各种动物细胞/组 织 基 因 组 DNA），2×Power PCR MasterMix，250 bp GeneRu1er DNA Ladder Mix。

1.3 核酸的提取 脾脏、肾脏、肝脏等组织，按北京百泰克公司细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）使用说明书提取。

1.4 PCR扩增及测序 按照Manua1 of Diagnostic Tests for Aquatic Anima1s-RED SEA BREAM IRIDOVIRAL DISEASE[4]建立的PCR检测方法进行RSIV的检测，基于虹彩病毒ATPase序列和DNA聚合酶系列分别合成两对引物1F/1R、2F/2R：

1F:5′-CTC AAA CAC TCT GGC TCA TC-3′；1R:5′-GCA CCA ACA CAT CTC CTA TC-3′；

2F:5′-CGG GGG CAA TGA CGA CTA CA-3′；2R:5′-CCG CCT GTGCCT TTT CTGGA-3′。

其中1F/1R能同时扩增RSIV/ISKNV病毒基因，目的产物570 bp；2F/2R特异扩增RSIV病毒基因目的产物568 bp。50 uL PCR反应体系：2×Power PCR MasterMix 25 uL，10 uM引物2 uL，模板DNA 4 uL ，ddH2O 17 uL。

PCR 程序 1：94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，30个循环；

PCR 程序 2：94℃ 30 s，54℃ 60 s，72℃ 60 s，30个循环。

PCR扩增结束后，经2.5%琼脂糖凝胶电泳检查扩增产物，检测到的阳性样品PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.5序列比对与分析 用引物1F/1R，2F/2R进行扩增产物序列测序，利用MEGE4.0软件将得到的序列与GENEBANK中的RSIV各株系进行同源性分析并构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 样本的PCR检测 取50 mg各组织样品经匀浆后，用北京百泰克公司细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。由引物1F/1R、2F/2R对样品进行PCR扩增分别获得571 bp及 536 bp两条目的条带(图1)，表明扩增产物为虹彩病毒特异片段。两条序列分别标记为1y1和1y2。从图2、图3中患鱼各组织PCR扩增情况可以看出，患鱼各器官组织中病毒数量不一样。图4中用引物1F/1R、2F/2R分别扩增同一阳性样品肾脏组织中的病毒发现目的条带的亮度存在明显差异，说明这两对引物对目的片段的扩增效率可能不一样。

图1 虹彩病毒PCR扩增

图2 引物1F/1R扩增不同组织中的RSIV/ISKNV病毒

图3 引物2F/2R扩增不同组织中的RSIV病毒

图4 引物1F/1R、2F/2R扩增同一阳性样品肾脏组织中的病毒

2.2 测序与构建系统发育树 将获得的两条特异系列1y1、1y2序列结果与GENEBANK中相似度最高的虹彩病毒毒株序列进行比对，并应用MEGE4.0软件对序列进行分析，结果如图5所示1y1序列与大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）聚在一起。图6所示1y2序列与真鲷虹彩病毒（RSIV）聚在一起。

1y1 序列(571 bp)：

ACCCAACCCCATCTCCTATCTCAAGCACAGTGAAC ATCTTTTACTTGTATAAAAATTTTGAATATCCTCAT GTCATAGGTGACTACTGTGAATCATAGCTACATGA GCAATGGCGACCCTGCTACTTCTTCTGTTGCTGACT GTGGCGTGTACTCACGCCACCACCTTCTATAACCT GGAAATCGACAACCAGACGACCACCCTCAGCTGC GGGGTACCTCGAGAGACGGATGTGAAGATTGTTT GGTCAAGCGACAGCAACAGCCTCTTGGCGGAGCA TGTTGTACATGGCGAGGTGGTCCATGTAGGCCGCA ACAGCAGTGAAGTCCTGAAGCATGGAGTGGTGCT GTATGACGGTACCATCTTGTCTGTCATCAAGCTGA AACCTCACCCTGTGCAGACCGTCACATGCCACGCC AGCCGCATCTCATCTGACAGTCAGCCTTGTGTAGG TGTCTCATGTGAGCTGCCAACAGACACCGATAATG TTACTCCACCGCCTACACTGCTTGACGATGGGGGC AGCGGAATGGACGACTACGATGACATAGATGAGC CAGGTTGTTTGAGA

图5 基于虹彩病毒ATPase序列构建的系统发育树

1y2 序列(536 bp)：

TTGGAGCGATGGTTGTTGTCGTCCCATTGCCGATA TCCTGCACACTCTTTGTCAGCACAAAGTCGTCATC TTGAAGCGCTCCCGGTATCATCATGTCGTGCATCA TGCGCACAGCAATGAATGGCACATCTGCAGACCC CTCAAGGATTGCACTCATGATTGCTGCATACGTGT TTCTGGCACACATGGCGCTGTCACGTCTGGACAAC ATGACACCCTTGCTGCCTGTTCGCTGCTTGCCGTCG CGTGTGAATGCCCTGTACACATAACGTTTCTTGGT GAAGATGATGAACTTGGTGTAGATGCACTGCTCAA ACTCGAGGCGCACCGGGCGCTCAAAGAAGGCCGA CACAGTGTCACTGGCGTTTACAGCCATCTGCCACA GTTCATCGAGTGATGCGCGGTCGTGGCCCAGCTGT ATGTAGCATGAGTCGGTGTCGCCGTACACAATGGT AGCGCCCACCACCGTCTTGAGGAGATGAGCGGCTT TCTCAATCAGCTTGCGGCCGCAGTATGTAGTCGTA TTTGGCCCCCGA

图6 基于虹彩病毒DNA聚合酶序列系统发育树

2.3 临床病料的收集与检测结果 根据临床症状，排除细菌和寄生虫感染，共采集到疑似患虹彩病毒性疾病的病料80尾。检测结果见表1。

表1 采样与检测结果

3 讨论

虹彩病毒是一类对鱼类、两栖类和爬行类水生动物具有广泛感染性的病原，由虹彩病毒感染所致的水产动物疾病已成为世界水产养殖业的严重问题[5]。在我国，多种鱼类虹彩病毒陆续被发现，其宿主几乎涵盖我国主要的海水养殖鱼类以及重要的淡水养殖鱼类，目前已报道的国内感染鱼类的虹彩病毒有真鲷虹彩病毒（RSIV）、传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、台湾石斑鱼虹彩病毒(TGIV)、大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)、大黄鱼虹彩病毒(LYCIV)等。在大黄鱼感染虹彩病毒的研究方面，1999年何爱华等[1]在福建省沿海人工养殖大黄鱼幼鱼脾脏中观察到疑似虹彩病毒颗粒，2003年陈新华等[2-3]报道了1999年至2001年夏季暴发流行于福建省宁德、罗源等地养殖大黄鱼幼鱼感染虹彩病毒并建立了PCR快速检测技术，并将其命名为大黄鱼虹彩病毒（Large ye11ow croaker iridovirus,LYCIV）。

虹彩病毒检测与鉴定的手段主要有组织病理学、形态学、免疫杂交、普通PCR、多重PCR、环介导等温扩增技术、荧光PCR、电镜等[6]。由于RSIV/ISKNV没有适合的细胞培养系，无法进行病毒增殖培养与分离，所以，PCR方法仍是OIE推荐的主要检测方法[7]。PCR方法具有灵敏度高、特异性操作简便、成本低廉和普遍适用等优点，所以，该方法已成为我国水生动物病毒检测的主要方法，非常适合用于未出现临床症状期间的早期检测，可用于疫病的防控。

本研究利用PCR法获得的两条病毒DNA基因片段1y1、1y2与分别与已报道的大黄鱼虹彩病毒（AY779031）和真鲷虹彩病毒（AB104413）高度相似。根据流行病学调查，罗源湾养殖大黄鱼“白鳃病”的发病水温 22～30℃，与何爱华[1]、陈新华[2-3]等报道的发病水温相似。由此判断，高温期罗源湾大黄鱼大面积发生的“白鳃病”养殖大黄鱼感染了虹彩病毒。

病毒类型还有待进一步的研究，存在1种或多种虹彩病毒混合感染的可能。采用OIE手册推荐的方法扩增产物为RSIV或ISKNV的特异片段，病样中扩增到的病毒DNA基因片段1y1系列与大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）特异片段高度相似，由此判断病样中病毒类型为大黄鱼虹彩病毒（LYCIV）、真鲷虹彩病毒（RSIV）和传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）中的1种或多种。图4中用引物1F/1R、2F/2R在同样的反应体系情况下分别扩增同一阳性样品肾脏组织中的病毒发现目的条带的亮度也存在明显的差异，也说明这个病样中可能存在不至一种病毒。

根据国际病毒分类委员会(ICTV)第8次报告真鲷虹彩病毒（RSIV）属虹彩病毒科细胞肿大病毒属[8]。细胞肿大病毒属病毒引起的疾病是一种全身性的感染，出现大量肿大细胞是细胞肿大病毒重要的感染特征之一。肿大细胞在鱼体的各个器官组织几乎均有分布，其中脾脏和肾脏中数量较多而在肝脏、鳃及脑中数量较少[7]。全身性失血和脾、肾肿大是大黄鱼“白鳃病”的典型症状。在病料的鳃丝、肝脏、脾脏、肾脏及性腺等组织器官中能检测到的组织为肝脏、脾脏和肾脏。观察检出的阳性病料的肝脏、脾脏和肾脏的PCR结果发现，虽然每种组织量一样，除去PCR效率因素，PCR目的片段条带亮度还是有所不同，说明病鱼各组织中病毒量可能有差异，其中肾脏组织中病毒含量最高（如图2-图3）。

何爱华[1]观察到的发病鱼体长5～10 cm。陈新华等[2]2001-2003年间对福建宁德、漳蒲及厦门等地鱼排进行了跟踪检测，发现该病毒在上述地区养殖场呈现不同规模的流行，发病鱼多为8～15 cm的幼鱼。本研究发现体长5～30 cm及以上的患鱼能检测到虹彩病毒基因特异目的片段（表1），说明该病毒在大黄鱼养殖生产上的危害的严峻性，有必要进一步跟踪检测研究。

[1] 何爱华,林奕坚,郭永健,等.大黄鱼幼鱼虹彩病毒感染的电镜研究[J].福建水产,1999(3):56-59.

[2] Chen X H,Lin K B,Wang X W.Outbreaks of an iridovirus disease in maricu1tured 1arge ye11ow croaker,Larimichthys crocea(Richardson)in China[J].Journa1of Fish Diseases,2003,26:615-619.

[3] 陈新华,董燕红.大黄鱼虹彩病毒PCR快速检测试剂盒的研制[J].生物技术,2005(3):38-40.

[4] OIE.Red Sea Bream Iridovira1 Disease Manua1 of Diagnostic Tests for Aquatic Anima1s[M].Paris:Office Internationa1des Epizooties,2009:251-261.

[5] 赵玉然,岳志芹,谭乐义,等.山东沿海部份地区真鲷虹彩病毒病初步调查与分析 [J].渔业科学进展,2011,32(6):31-36.

[6] 萧枫,张奇亚.水生动物虹彩病毒的分子生物学[J].水生生物学报,2004,28(2):202-206.

[7] 李华,孙志鹏,李强,等.条石鲷检出的虹彩病毒特性研究[J].病毒学报,2011,27(2):158-164.

[8]洪健,周雪平.ICTV第八次报告的最新病毒分类系统[J].中国病毒学,2006,21(1):84-96.