EdU标记涡虫体内多能干细胞neoblast的方法

刘殿辰, 王玲燕， 赵博生

(1.山东理工大学 生命科学学院， 山东 淄博 255091； 2.山东大成农化有限公司， 山东 淄博 255009)

涡虫具有强大的再生能力，除咽部和最前端的头部外，任何大于104个细胞的片段都能再生为一个完整的个体[1-2]；另外由于其分布广、取材方便，涡虫已经成为研究发育和再生的模式动物[3].涡虫强大的再生能力是基于体内存在大量的多功能干细胞(neoblasts).Neoblasts是1892年Randolph在研究成熟涡虫(Schmidteamediterranea)时发现的类似于胚胎细胞的未分化小细胞[4]，是涡虫体内唯一有多功能分化活性的细胞[5]，直径为5～10μm，均匀分散于表皮和肌肉下的实质组织中.2005年Orii等利用抗血清对neoblasts进行了十分清晰的定位，发现neoblasts在背腹间质中呈分散分布，在背部间质中沿中线和两侧线成簇分布[6].

涡虫在再生过程中，在实质组织中，一定数量的neoblasts接受上皮组织的应激信号，开始增殖，其后代细胞迁移，并产生胚基；2000年 Newmark和 Alvarado通过喂食涡虫5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine, BrdU)，在涡虫中成功运用BrdU掺入实验[5]，不仅可以检测增殖的干细胞，又可以追踪干细胞分化后的命运，这为后人研究涡虫的再生提供了很好的分子标记工具.然而，由于双链DNA互补配对的碱基会阻碍抗体和BrdU亚基的结合，从而影响了neoblasts的标记效率.为了暴露出BrdU的抗原决定簇，涡虫标本必须经过强烈的变性，比如浓盐酸或乙酸和甲醇的混合液处理.这些强烈的化学处理总会破坏标本的原来结构，从而使得BrdU染色的敏感程度和效果取决于样品处理的条件[7].

EdU(5-Ethynyl -2′-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，与BrdU检测方法相比，EdU检测方法更快速、更灵敏、更准确.而且EdU染料的分子量只有BrdU抗体的1/500，在细胞内很容易扩散，无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)，可有效避免样品损伤.本研究基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测细胞DNA复制活性的机制，旨在探索EdU能否标记涡虫体内的neoblasts，为涡虫再生机制研究和成体干细胞提供新的分子标记物.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 东亚三角涡虫

东亚三角涡虫(Dugesiajaponica)采集于山东省博山泉河头，并饲养于灭菌并充氧过夜的凉开水中，每周喂食猪肝一次，试验用涡虫一周前停止喂食.

1.1.2 仪器

德国Leica公司生产的激光共聚焦扫描显微镜，日本尼康公司生产的显微操作系统，上海天平仪器厂生产的电子分析天平FA1004，上海医疗器械五厂生产的电热恒温水浴锅HHS，江苏金坛国胜仪器厂生产的石英自动双重纯水蒸馏器1810-B等.

1.1.3 试剂

EdU试剂盒购自于广州市锐博生物科技有限公司，其它试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 涡虫的选取及注射

选取大小适中(长约5 mm)的涡虫约30条，将选好的涡虫置于冰上冷冻麻醉.将EdU试剂盒中的试剂A用PBS溶解，稀释浓度为0.5 mg/mL.将冷冻麻醉好的涡虫置于显微注射系统下注射，每条涡虫注射0.6μL.然后将注射好的涡虫轻轻地转移到干净的培养皿中培养12 h.

1.2.2 涡虫的固定

将注射后培养12 h的涡虫切割为头、中部和尾部，头端沿眼点后缘切割，尾端沿咽部后缘切割，将切割好的涡虫中部转移至培养皿中继续培养，然后分别于3 h、6 h和12 h取出10条用2%的盐酸杀死并用多聚甲醛固定2 h.

1.2.3 染色

用PBS清洗涡虫3次，每次10 min，加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10min，PBS清洗2次..根据EdU产品说明书配制1×Apollo染色反应液(现用现配)，加入100μL染色反应液避光、室温孵育30min，弃染色反应液，加入渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)清洗3次，每次10 min，加入甲醇清洗2次，每次5 min，弃甲醇，PBS清洗.

1.2.4激光共聚焦扫描显微镜观察拍照

选用波长550 nm的激光激发Apollo染料，扫描拍照，并用Leica TCS图像分析软件对照片进行数据分析.

2 结果与分析

2.1 细胞形态与分布的观察

激光共聚焦扫描显微镜观察显示：EdU阳性细胞个体较小，呈球形或近球形，除头部前端和尾部末端未见分布外，主要分布在头部后端、中部和尾部前端，而且呈现在背腹间质中呈分散分布，背部间质中沿中线和两侧线成簇分布(图1).EdU阳性细胞特点和分布结果与Orii等[6]用BrdU标记的neoblasts的研究结果完全吻合，因此，可以确定EdU已对neoblasts成功标记.

图1 Edu标记的neoblasts在再生12h涡虫体内的分布图

2.2 涡虫再生初期neoblasts数量变化分析

为了确定涡虫再生初期neoblasts的数量变化和EdU的标记效果，分别对再生3 h、6 h和12 h的涡虫中部EdU阳性信号荧光相对强度进行采集，并进行数据统计分析，结果表明：在涡虫再生的初期，随着neoblasts的分裂和数量的增多，荧光相对强度逐渐增强，再生12 h达到最大值(图2)，这与neoblasts在再生过程中的细胞行为和细胞状态相一致.

图2 涡虫中部再生3h、6h、12h体内neoblasts数量变化图谱

3 讨论

涡虫具有惊人的再生能力，即使是小到虫体1/279的涡虫组织仍然能够再生出一个完整个体，其再生过程依赖于体内neoblasts的分裂、迁移和分化.neoblasts是涡虫成体内唯一具有增殖能力和自我更新能力的体细胞，也是体内唯一能分化为神经细胞、生殖细胞等近40种细胞类型的原始细胞[6-8]，因此，探索涡虫再生过程中neoblasts快速有效的标记方法，已经成为再生机制研究的基础.

目前常用的neoblasts标记物BrdU，是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可在细胞分裂的S期代替胸腺嘧啶核苷掺入到正在复制的DNA分子中去，再利用抗BrdU的抗体通过免疫组织化学染色显示增值的细胞.但是由于BrdU在染色上存在的缺陷，标记涡虫体内neoblasts时，需要对样本进行强烈的化学处理，从而影响了敏感程度和标记效果[7]，并且，BrdU标记步骤繁琐，需要通过抗原-抗体反应才能显现标记效果.EdU(5-Ethynyl -2′-deoxyuridine)作为另一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞增殖时期能够代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，与BrdU检测方法相比，EdU的荧光染料Apollo的分子只有BrdU抗体的1/500，在组织和细胞内更容易扩散，检测方法更快速、更灵敏、更准确，而且无需进行化学处理，可有效避免样品损伤，因此，基于EdU与Apollo荧光染料的特异性反应快速检测涡虫体内neoblasts是一种可行有效的方法.

本实验室通过注射EdU对再生涡虫体内的neoblasts进行标记，结果表明，EdU不仅能够对neoblasts成功标记，而且比传统标记物BrdU更快速、更灵敏、更准确.另外，通过对涡虫中部再生3 h、6 h和12 h的EdU阳性信号的荧光相对强度分别进行统计分析，结果表明，随着涡虫再生过程的进行，荧光相对强度逐渐增强，从而说明neoblasts的数量正在增加，这与再生过程中neoblasts的细胞动力学特征相一致.研究结果为涡虫再生过程中neoblasts的标记提供了又一个分子标记工具，为涡虫再生的机制研究奠定了基础.

[1] Morgan T H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculate[J]. Development genes and evolution,1898(7):364-397.

[2] Montgomery J R, Coward SJ. On the minimal size of a planarian capable of regeneration[J]. Trans. Am.Microsc.Soc, 1974,93:386-391.

[3] Alvarado S A, Kang H. Multicellularity, stem cells, and the neoblasts of the planarian Schmidtea mediterranea[J]. Exp. Cell Res,2005,306:299-308.

[4] Randolph H. The regeneration of the tail in lumbriculus[J]. J. Morphol, 1892, 7:317-344.

[5] Newmark P A, Alvarado S A. Bromodeoxyuridine specifically labels the regenerative stem cells of planarians[J]. Dev. Biol,2000,220:142-153.

[6] Orii H, Sakurai T, Watanabe K. Distribution of the stem cells (neoblasts) in the planarian Dugesia japonica[J]. Dev Genes Evol, 2005, 215 (3) : 143-157.

[7] Salic A,Mitchison T J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo[J] .Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105(7):2415-2420.

[8]Newmark P A，Saha S，Juste R，etal．Planarian regeneration：revisiting a classic problem using modelmethodologies[J]．Developmental Biology，2000，222(1)：231．