杠柳苷对急性淋巴细胞白血病作用机制研究

杨东光，周晋，王振坤，叶向梅，李洋，王洪玲，曹峰林

(哈尔滨医科大学附属第一医院中心血液实验室，黑龙江 哈尔滨 150081)

香加皮(cortex periplocae)为萝摩科(A sclepiadaceae)植物杠柳(Periploca Sepium Bunge)的根皮［1］，始载于《神农本草经》。主产于东北和华北地区，含有甾醇、甙类、酯类等多种化学成分［2－3］。《中华人民共和国药典》记载，香加皮主要功能为祛风湿、强筋骨，常用于风寒湿痹、腰膝酸软、心悸气短、下肢浮肿的治疗。香加皮提取物杠柳苷(Periplocin from cortex periplocae，CPP)是从香加皮正丁醇萃取纯化得到的抗肿瘤单体化合物［4］，又名杠柳毒苷、萝蘑毒苷、五加皮苷G等，已经有研究报道对多种实体肿瘤细胞株增殖具有较强的抑制作用，但其对白血病细胞株的疗效及机制尚未见报道。CPP的化学结构为C36H56O13，属强心苷类［5］化合物，近年来的研究发现，这类药物具有显著和靶向性的抗肿瘤效应［6］。本实验探讨CPP对人类急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞株Jurkat是否具有抑制作用，并从诱导凋亡、抑制HIF－1α和糖酵解三方面探讨CPP对ALL的作用机制。

1 实验材料与方法

1．1 细胞株与药物

人类ALL细胞株Jurkat使用含10%胎牛血清(杭州四季青)和浓度为100 IU/M青链霉素(Invitrogen)的1640培养基中(Gibco)，置于37℃细胞培养箱中长期培养。CPP由华北制药厂提供。

1．2 CASY快速细胞计数法评估CPP对各细胞的敏感性

取对数生长期的Jurkat，以5×104个/孔浓度将细胞悬液接种于6孔培养板，每孔接种950μl悬液，分别加入50μl CPP，终浓度为0．05μM。并分别设置空白对照组，空白对照组加入等体积完全培养基，置于37℃饱和湿度5%CO2条件下常规培养72h，分别于24、48、72h收集细胞，无菌PBS洗3次。CASY快速细胞计数法进行细胞计数及细胞存活率检测，评估CPP对各组细胞的抑制作用。

1．3 Annexin－V/PI双染检测细胞凋亡

收集经过不同浓度CPP处理24h、48h和72h的Jurkat细胞，用预冷的1×PBS洗2次。每管用1×binding buffer把细胞调整成1×106个/ml浓度，取100μl加入5μl的AnnexinV－FITC溶液进行染色，轻轻混匀，再加入5μl的PI溶液染色。双染后在室温避光静止15min后每管再加入1×binding buffer 400μl，在1h内上流式细胞仪进行凋亡检测。每份样品同设3份，求平均值和标准差。

1．4 实时定量PCR

采用TRIzol分别对细胞株的总RNA进行抽提，然后逆转mRNA至cDNA。应用primer Express 2．0软件(ABI公司)设计qRT－PCR引物，并交由上海生工合成，引物序列见表1。应用 FastStart Universal SYBR Green PCR Master(罗氏)试剂盒，依据上海生工提供的退火温度设定反应条件，进行目的基因扩增。所有对目的基因的检测，均重复3次，取平均值。使用2－△△CT计算处理前后基因变化的比值。

表1 Hh信号转导通路基因引物

1．5 统计学处理

2 结果

应用CASY快速细胞计数法对50nM的CPP连续作用72h的Jurkat细胞生长进行了评估。尽管CPP作用后，Jurkat细胞依然具有生长的趋势，但与对照组相比，其生长仍然显著受到抑制，如图1所示。

图1 Jurkat细胞在CPP 50nM作用下生长曲线

采用浓度为 0、12．5nM、25nM、50nM、100nM 的CPP连续应用于Jurkat细胞48h，采用方差分析对数据进行统计。实验结果表明，CPP诱导Jurkat凋亡呈剂量依赖性(F=147．18，P ＜0．001)，其凋亡率随着剂量的增加明显增加，如图2所示。

图2 不同浓度杠柳苷诱导Jurkat细胞调亡

经不同浓度的CPP连续作用于Jurkat细胞株12h后，本实验对标本的目的基因进行了有效扩增。同时，熔解曲线表明，qRT－PCR的扩增特异性强，无明显的引物二聚体或其他非特异性杂带出现(见图3)。结果表明，CPP对糖酵解相关基因的表达具有显著抑制作用，该抑制作用呈剂量依赖性，即随着CPP浓度的增大，各基因的表达逐渐下降(P＜0．05)(见图4)。

图3 目的基因的溶解曲线与扩增曲线

图4 不同浓度杠柳苷抑制糖酵解相关基因表达

3 讨论

已有研究显示，香加皮提取物对体外培养的肿瘤细胞有显著的细胞毒性，证实香加皮提取物通过诱导人乳腺癌MCF7细胞、人胃癌BGC－823细胞凋亡而产生明显的增殖抑制活性，作用强度呈浓度和时间依赖性。杠柳苷(CPP)是从香加皮正丁醇萃取纯化得到的抗肿瘤单体化合物，已经有研究报道［7－10］，CPP对食管癌、结肠癌、胃癌、肝癌、乳腺癌多种实体肿瘤细胞株增殖具有较强的抑制作用，并能显著诱导上述肿瘤细胞凋亡和细胞周期阻滞。

鉴于CPP对白血病细胞的作用效果及其机制尚不清楚，本研究首先应用casy快速细胞计数法检测CPP是否对ALL细胞株Jurkat具有抑制作用。本实验发现，Jurkat是CPP作用较为敏感的白血病细胞株之一。为了验证CPP抗急性淋巴细胞白血病是否通过诱导细胞凋亡起作用，本实验采用不同浓度的CPP连续作用急性淋巴细胞白血病细胞株48h，并采用流式细胞术监测细胞的凋亡率。结果发现，CPP可诱导白血病细胞凋亡，凋亡率随CPP药物浓度增加而增大，即CPP诱导急性淋巴细胞白血病凋亡剂量呈依赖性。实验结果证明，诱导细胞凋亡是CPP对抗急性淋巴细胞白血病的机制之一。

ALL是儿童急性白血病的主要类型，约占其中的80% ～85%，成人ALL亦较多见。ALL细胞对化疗药物耐药，尤其是对糖皮质激素(GC)耐药是导致儿童和成人ALL疗效和预后差异的主要原因。最近的研究发现，糖酵解的异常活化是急性淋巴细胞白血病耐药的一个重要原因。糖皮质激素耐药细胞的糖消耗量显著增加，而抑制糖酵解能增加耐药的急性淋巴细胞白血病患者的白血病细胞对糖皮质激素的敏感性。以糖酵解为靶向将有望调节急性淋巴细胞白血病糖皮质激素耐药。

HIF－1α是与恶性肿瘤生长进程密切相关的转录调节因子，它以异源二聚体的形成存在。可通过增强血管新生，促进细胞能量代谢，抗细胞凋亡等机制在肿瘤发生转移以及肿瘤治疗耐药等方面发挥重要作用。与正常组织相比，恶性肿瘤对葡萄糖的摄取及代谢均处于增高状态，糖代谢增加是许多恶性肿瘤组织的显著性特征，依赖于肿瘤自身调节机制，以满足肿瘤快速生长的需要。Glutl是葡萄糖转运蛋白家族的成员之一，是哺乳动物细胞转运葡萄糖的载体。Glutl在缺氧状态下表达明显增加，与HIF－1α一起作为内源性缺氧标记物来检测肿瘤内的缺氧情况，成为研究恶性肿瘤的发生、发展及预后的重要指标之一。已糖激酶(Hexokinase，HK)是糖酵解的第一个限速酶，它能催化葡萄糖磷酸化生成6－磷酸葡萄糖。若抑制该酶的活性，则抑制了肿瘤细胞的糖酵解使肿瘤细胞不能获得足够的磷酸葡萄糖。在缺氧条件下，ALL细胞株Jurkat的HIF－1α mRNA和蛋白表达均显著增强，从而诱发HIF－1α一系列下游基因的激活，使该白血病细胞获得生存优势。50nM CPP能显著抑制HIF－1α下游的靶基因，糖酵解的关键酶－已糖激酶II以及Glutl的mRNA表达。我们的实验结果证实，CPP能诱导急性淋巴细胞白血病细胞凋亡，并可能是通过HIF－1α－HKII这条通路抑制急性淋巴细胞白血病的糖酵解途径，杀伤白血病细胞。

［1］ 中华人民共和国药典委员会．中华人民共和国药典［S］．北京:化学工业出版社，2000:211．

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［4］ 单保恩，赵连梅，何兰欣，等．杠柳苷对人食管癌细胞增殖的抑制作用及与Rb蛋白表达的关系［J］．癌变·畸变·突变，2008，20(5):342－345．

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