开心散改善Aβ1－42所致在体小鼠海马LTP抑制的实验研究

黄树明，任丽民，李健英，张博，范越

(1．黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江 哈尔滨 150040;2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)以记忆力减退、认知障碍、性格改变为主要临床表现，其主要病理特征为脑内淀粉样蛋白(amyloid beta peptide，Aβ)沉积并形成不溶性的老年斑(senile plaque)。现已明确，在老年斑形成之前小分子可溶性Aβ寡聚体就已对动物记忆的形成以及海马长时程增强(long－term potentiation，LTP)产生抑制［1］，而海马 LTP 的产生是记忆形成过程的关键环节。开心散始见于孙思邈的《备急千金要方》，由“远志、人参各四分，茯苓二两，菖蒲一两”组成，为益智健脑之代表方剂。研究发现，开心散可改善痴呆动物模型记忆力［2］。本实验采用活体动物海马LTP的记录，观测在LTP被Aβ1－42抑制情况下，开心散的治疗作用，以期阐明开心散改善AD患者记忆功能障碍的神经生理学基础。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 动物分组

10周龄清洁级ICR小鼠，体质量25～35g，雌雄不限，60只。随机分为正常对照组、Aβ组和Aβ加开心散组。Aβ组及Aβ加开心散组动物侧脑室注射Aβ，对照组注入等体积生理盐水。于实验前2天给予Aβ加开心散组小鼠灌胃开心散0．3ml(含生药量4g/ml)，每日1次，共计3天，空白对照组及Aβ组动物灌胃等体积生理盐水。

1．1．2 实验仪器

小鼠脑立体定位仪(NARISHIGE);刺激电极(钨制同轴金属电极);玻璃记录电极(内充ACSF);放大器(DAM80);刺激装置(NIHON KOHDEN);电刺激装置(NIHON KOHDEN);数据获取装置(Molecular Device);动物恒温系统(上海奥尔科特生物科技有限公司);跳台实验装置(中国医学科学院药物研究所)。

1．2 方法

1．2．1 跳台实验

将小鼠放于跳台装置的金属栅上，适应5min后，底部金属栅通电，小鼠经电击便躲避并最后跳上安全台。如此反复训练3次，记录跳上安全台的时间(跳上时间)。24h后将小鼠放在安全台上，金属栅通电，记录小鼠第一次跳下平台的时间(躲避时间)以及5min内小鼠从台上跳下的次数(错误次数)。

1．2．2 海马在体LTP记录方法

小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(45mg/kg)麻醉后固定于脑立体定位仪上，切开头部皮肤，暴露颅骨，在相应的位置(Bregma后1mm，旁开1.75mm)用骨钻在颅骨上钻孔。微量进样器自脑表面垂直进针，深度为硬脑膜下1．8mm，将浓度为1μm 的 Aβ1－42缓慢注入侧脑室5μl，注射经时10min，并留针10min以防液体外溢。实验过程中用电热毯维持动物体温于37℃。

突触后电位的记录选择贯通纤维束(Perforant pathway)－齿状核(dentate gyrus，DG)通路。刺激电极的尖端定位在海马Perforant pathway侧枝处，坐标为Bregma后4．5mm、中线右侧旁开3．0mm，深度为皮层下1.5～2．0mm;记录电极尖端定位在DG区分子层，坐标为Bregma后2．1mm、中线右侧旁开1．5mm，深度为皮层下1．8～2．2mm;参考电极固定于后头部皮肤表面。以波宽为0．6ms，频率为0．067Hz的电刺激诱发并记录fEPSP，待基础记录稳定15min后，给予高频刺激(High frequency stimuli，HFS)以诱发 LTP(100Hz，1sce)，然后连续观察记录90min。LTP以fEPSP锋电位(population spike)振幅增加的百分比表示。

1．3 统计学处理

2 结果

2．1 Aβ及开心散对小鼠学习记忆功能影响的行为学检测

通电后三组小鼠跳上安全台的平均时间无明显差异，即小鼠的基础智力水平无差异。训练24h后，与正常对照组相比，Aβ侧脑室注射小鼠的躲避时间明显缩短，同时错误次数明显增多，统计学处理显示两个指标在两组间均存在显著差异(P＜0．01)，证明侧脑室注射Aβ可以引起动物记忆功能的损伤。Aβ加开心散组与单纯Aβ组相比，动物在安全台上的躲避时间明显延长(P＜0．05)，同时误走下跳台的错误次数也大幅减少(P＜0．05)，提示口服开心散可以改善Aβ诱导的动物记忆功能损伤。如表1所示。

表1 开心散对Aβ诱导的小鼠学习记忆功能的影响(±s)

表1 开心散对Aβ诱导的小鼠学习记忆功能的影响(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0．01;与 Aβ 组比较，#P ＜0．05。

7 16．29 ±11．98 277．71 ±58．96 0．29 ±0．48 Aβ 组 8 12．87 ±10．00 57．88 ±48．59*1．75 ±0．70*Aβ 加开心散组 9 15．56 ±12．58 182．00 ±123．18#0．78 ±0．83错误次数对照组组别 n跳上时间(s)躲避时间(s)#

2．2 侧脑室注射 Aβ1－42及灌胃开心散对小鼠海马LTP的影响

海马LTP的形成是记忆形成过程的关键步骤，前面行为学结果显示，侧脑室注射Aβ可诱发动物学习记忆功能障碍，而灌胃开心散可以逆转此状况，提示开心散可改善Aβ使神经细胞突触传递LTP形成受到的抑制。因此用活体动物检测了海马LTP，结果表明，对照组、Aβ组及Aβ加开心散组小鼠海马在给予高频刺激HFS前的基础刺激所诱发的EPSP波形并无差异。给予HFS后，在三组动物均观察到LTP被诱发，表现为fEPSP波振幅和上升斜率增大。在HFS后90min时，对照组小鼠fEPSP锋电位平均振幅比HFS刺激前增加(137．30±96．12)%，而Aβ组小鼠fEPSP锋电位平均振幅增加(21．08±29．45)%，其增加幅度仅仅约为对照组的1/6，统计学处理显示两组间存在显著性差异(P＜0．01)，提示Aβ通过抑制海马神经元突触的可塑性功能而抑制了小鼠的记忆及功能。Aβ加开心散组小鼠的fEPSP锋电位平均振幅比HFS前增加(93．93±74．11)%，约为单纯 Aβ 组的4.5倍，两组间存在显著差异(P＜0．05)。提示开心散可逆转Aβ对海马神经元突触LTP形成的抑制，从而改善动物的记忆能力(见图1)。

图1 三组小鼠LTP比较

3 讨论

AD以记忆力减退、认知障碍、性格改变为主要临床表现。神经病理学上表现为脑皮质及海马区Aβ沉积产生的老年斑和细胞骨架蛋白tau的高度磷酸化形成的神经纤维缠结以及大脑皮层和海马区突触形态改变及神经元丢失。其中Aβ的生成、代谢及其神经毒性是AD发病的关键关节。研究证实，Aβ寡聚体是一种神经毒素，可与神经突触结合并阻碍其功能，引起记忆丢失和相关的神经损害。同时，电生理学研究证实，Aβ聚合成寡聚体后可直接对神经突触传递可塑性产生抑制［3］。Aβ寡聚体对海马神经元突触信息传递LTP的抑制无疑是导致学习记忆功能障碍的关键环节［4－5］。

开心散具有开心益智之功。研究发现，开心散可以提高动物脑内胆碱能神经系统功能，提高AD动物模型学习记忆功能;可以增加脑组织中超氧化物歧化酶活性，清除体氧化物自由基，提高动物抗氧化应激能力［4］。但是至今为止，开心散改善Aβ诱导的动物学习记忆功能低下的神经生理学机制依然不清楚。研究表明，海马神经元突触信息传递的LTP是记忆形成过程中的关键环节，因此本研究采用行为学及电生理学活体记录的实验手段，探索了开心散改善AD病因蛋白Aβ诱导动物学习记忆功能障碍的的神经生理学机制。

实验结果表明，侧脑室注射Aβ1－42后，动物记忆功能明显降低，同时其海马神经元突触传递LTP亦明显受到抑制，说明Aβ通过抑制海马LTP这一机制诱发动物记忆形成障碍。而口服开心散后动物在学习记忆功能得到恢复的同时，海马LTP也明显改善。本研究结果表明，开心散改善AD模型动物学习记忆功能的神经生理学机制是其阻断了Aβ对中枢神经突触信息传递LTP的抑制。

［1］ Balducci C，Beeg M，Stravalaci M，et al．Synthetic amyloid－beta oligomers impair long－term memory independently of cellular prion protein［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(5):2295－2300．

［2］ Nishiyama N，Zhou Y，Saito H．Ameliorative effects of chronic treatment using DX－9386，a traditional Chinese prescription，on learning performance and lipid peroxide content in senescence accelerated mouse［J］．Biol Pharm Bull，1994，17(11):1481－1484．

［3］ Walsh DM，Klyubin I，Fadeeva JV，et al．Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal longterm potentiation in vivo［J］．Nature，2002，416(6880):535－539．

［4］ 温薇，金在顺，周敏，等．开心散影响突触可塑性的研究进展［J］．中医药学报，2010，38(2):140－141．

［5］ 李福东，王艳华，张超，等．开心散含药脑脊液对无血清培养PC12细胞的促生长作用［J］．中医药学报，2012，40(6):12－14．