THP-1细胞系白血病干细胞的检测、分选及鉴定

王颖超，冯 磊，殷楚云，魏永纬，马丽娜，王春美，盛光耀

郑州大学第一附属医院儿科;河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州450052

△男，1970年12月生，硕士，副教授，研究方向:儿童血液与肿瘤方向，E-mail:yingchaowang152@163.com

急性白血病(acute leukemia，AL)是起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，发病率较高，在儿童和青少年恶性肿瘤中发病率居首位［1］，其中儿童急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)治疗难度较大(除隐性早幼粒细胞白血病外)，虽然目前完全缓解率显著提高［2］，但耐药和复发仍然非常普遍，长期生存率更低［3］。AML 与干细胞关系非常密切，白血病患者体内存在极小一群非常特殊的细胞，即白血病干细胞(leukemia stem cells，LSCs)，LSCs对常规的化疗药物不敏感，AML 的发生、复发均与这一小群LSCs 有关［4］。作者以人急性单核细胞白血病THP-1 细胞为研究对象，通过流式细胞术检测、分选CD34+CD38－的细胞，并进一步观察其生物学特性，为下一步深入研究LSCs 的特异表面标志分子和靶向治疗等后续工作打下基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞株及试剂 非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠40 只，6～8 周龄，雌雄不限，体质量约15 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。THP-1 细胞购自中科院上海细胞库研究所。碘化丙啶(PI)、阿糖胞苷(Sigma 公司，美国)，青、链霉素(索莱宝公司，中国)，改良型RPMI 1640 培养基、优级胎牛血清(Hyclone 公司，美国)，小鼠抗人CD34-PE 单克隆抗体、小鼠抗人CD38-FITC 单克隆抗体、小鼠抗人IgG1-PE、小鼠抗人IgG1-FITC(eBioscience 公司，美国)，组织RNA 提取试剂盒(Biomiga 公司，美国)，MMLV 逆转录试剂盒、PCR 扩增试剂盒(Fermentas 公司，立陶宛)，DNA Marker、引物合成(上海生工生物工程技术服务有限公司)。

1.2 细胞培养 THP-1 细胞用含体积分数20%胎牛血清、体积分数1%青链霉素的RPMI 1640 完全培养基，在37℃、体积分数5%CO2的细胞培养箱内培养，每隔48 h 换液传代。

1.3 LSCs 的检测及分选 取对数生长期的THP-1细胞，1 500 r/min 离心10 min，离心2 次，加PBS 制成单细胞悬液(106mL－1)，加入3 只试管，分别加入以下单克隆抗体试剂:鼠抗人CD34-PE 和鼠抗人CD38-FITC，同型对照分别加入IgG1-PE、IgG1-FITC，同时设置阴性对照。充分混匀后4℃下避光染色20 min。染色完成后1 000 r/min 离心10 min，洗涤2 次，加入PBS 稀释样本至500 μL，重悬细胞，上流式细胞仪测定，采用CELLQUEST 软件分析。打开分选软件，设置左右收集的细胞群;换上偏振板，调整参数，使偏振板在最佳位置，打开左、右分选通道，使左右两条液流分开，开始分选;待收集结束，离心收集细胞。重复测量10 次。

1.4 细胞周期的检测 取分选后的LSCs组、非LSCs组单细胞悬液，离心洗涤，加入配好的PI 及透膜剂，室温下避光孵育20 min，10 g/L 多聚甲醛固定24 h 以上，上机前过滤细胞以防部分聚集成团的细胞堵管。收集10 000 个细胞，记录并分析G0/G1、S和G2/M 期细胞的比例。

1.5 ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因表达的检测采用实时荧光定量PCR 方法，根据试剂盒说明书对分选后LSCs 和非LSCs 提取总RNA，逆转录合成第一链cDNA 后－70℃保存或直接进行荧光定量PCR 反应，以GAPDH 为内参。使用ABI7500 光定量PCR 仪进行扩增。GAPDH 上游引物序列5'-AC CACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列5'-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3';ABCG2:上游引物序列5'-GTCTAAGCAGGGACGAACAATC-3'，下 游 引 物 序列5'-GCCAATAAGGTGAGGCTATCAA-3';ABCB1 上游引物序列5'-TGGTGTTTGGAGAAATGACAGAT-3'，下游引物序列5'-GAAACCTGAATGTAAGCAGCAAC-3';Bcl-2 上游引物序列5'-GTGGATGACTGAATAC CTGAACC-3'，下游引物序列5'-AGACAGCCAG GAGAAATCAAAC-3';Bax 上游引物序列5'-GGTT GTCGCCCTTTTCTACTT-3'，下游引物序列5'-GT GAGGAGGCTTGAGGAGTCT-3'。反应体系反应条件:98℃预变性2 min;98℃变性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸40 s，40 个循环;72℃再延伸8 min。

1.6 NOD/SCID 小鼠白血病模型建立 将35 只NOD/SCID 小鼠随机分成7组，每组5 只，A～C组经尾静脉分别注射104、105、106个非LSCs;D～F组分别注射103、104、105个LSCs;G组(阴性对照组)经尾静脉或腹腔注射无菌PBS，注射剂量均为0.2 mL。自接种日起每日观察小鼠成瘤情况，记录各组小鼠生存时间。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0 处理数据。应用两独立样本的t 检验比较LSCs组、非LSCs 细胞周期及ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因水平的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 LSCs 的分选 重复测量10 次，THP-1 细胞株中存在免疫表型为CD34+CD38－的LSCs，比例为(0.12±0.06)%;收集分选后LSCs 管细胞再次上流式细胞仪进行检测，细胞集中于之前的LSCs 区域，比例为(97.00±1.70)%。

2.2 LSCs 细胞和非LSCs 细胞细胞周期分析 见表1。

表1 细胞周期分析 %

2.3 LSCs 细胞和非LSCs 细胞不同基因表达水平的比较 见表2。

表2 LSCs 细胞和非LSCs 细胞不同基因表达水平的比较

2.4 不同分组小鼠成瘤情况比较 小鼠在接受不同处理后，除E组和G组各有1 只在观察过程中死亡，余均存活4 周以上。1×103数量的LSCs 可在4周后形成典型的NOD/SCID 小鼠白血病浸润模型，非LSCs 至少需要1×106才能成瘤，成瘤率远低于LSCs 移植组。LSCs组小鼠多在发病后1～2 周内死亡，平均生存时间为(31±2)d，而非LSCs组平均生存时间为(39±2)d，差异有统计学意义(t =7.124，P ＜0.001)。

3 讨论

LSCs 因具有自我更新、多向分化和无限增殖的能力，可能是导致白血病耐药及复发的根源［5］。然而，由于缺乏高度特异的细胞免疫表型，使得LSCs的分离纯化一直是亟待解决的难题之一。Feller等［6］报道了免疫表型为CD133+和(或)CD34+的人AML LSCs。LSCs 细胞表型可能还包括CD123［7］、CD96［8］、CLL-1［9］、CD47［10］、CD44［11］等。诸多LSCs免疫表型存在争议，但是CD34、CD38 仍作较经典的白血病起始细胞表面标志被许多研究所采用。该研究结果显示，在对数生长期的THP-1 细胞中，CD34+CD38－细胞的比例为(0.12±0.06)%。

研究［12］发现，90%以上的LSCs 处于细胞分裂周期的G0期，干细胞生长因子等一般难以把这些LSCs 从G0期活化刺激进入细胞增殖周期。该研究也发 现，LSCs G0/G1期 细 胞 比例 达(94.03±1.61)%，明显高于非LSCs，初步证实在THP-1 细胞中确有小部分细胞处于细胞周期中的静止状态，即LSCs。这些LSCs 比普通白血病细胞更能有效地抵御化疗药物的伤害，并能产生药物耐受。

ABC 转运体的高表达可以将许多抗肿瘤药物逆向转运出到细胞外，使抗肿瘤药物不能进入到细胞内积聚发挥作用，也是LSCs 耐药的主要原因之一。AML 患者中LSCs 相对于骨髓造血干细胞有更高的ABC 转运体相关基因ABCB1 和ABCG2 的表达［13］。该研究结果显示:LSCs 亚群ABCG2 和ABCB1 基因的表达水平明显高于非LSCs 亚群，亦证实了这一点。

凋亡逃逸也是造成LSCs 耐药的主要原因之一［14］。Bcl-2/Bax 比例上调在肿瘤的发生和发展中有着极为重要的意义［15-16］。该研究显示，与非LSCs比较，LSCs 亚群Bcl-2 的相对表达量增加，虽然Bax的表达在两亚群细胞中差异无统计学意义，但是，LSCs 亚群Bcl-2/Bax 比值显著升高。这一结果表明LSCs 比非LSCs 具有更强的凋亡逃逸现象，在临床上表现为对诱导凋亡药物不敏感，从而导致复发。

LSCs 不同于正常干细胞最显著的一点是具有高致瘤性，作者建立模型后发现:103的LSCs 早期(接种后3 周)即可在NOD/SCID 小鼠检测到白血病细胞。而非LSCs组至少需要106个细胞才能成瘤，而且发病时间晚，这说明LSCs 亚群侵袭性更高，具有高致瘤性。

综上所述，THP-1 细胞中存在小部分细胞，该部分细胞具有CD34+CD38－细胞免疫表型，处于静止的周期状态，高表达耐药基因和抗凋亡基因，具有干细胞的生物学特性及体内致瘤性。

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