新型截短侧耳素衍生物的体外抗菌活性研究*

赵 喜，王新杨，黄金华，凌 勇

（南通大学医学院药学实验室，江苏226001）

金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是医院感染中最常见的病原菌,可以引起败血症、菌血症、呼吸道感染、人工关节感染、尿路感染、骨髓炎、伤口感染等多种疾病。随着抗生素的广泛应用，细菌的耐药性呈上升趋势，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）和耐甲氧西林表皮葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus epidermids,MRSE)在临床上耐受多种抗菌药物。截短侧耳素是高等真菌担子菌纲侧耳素属Pleurotus mutilus和Pleurotas passeck-rianus菌种经深层培养产生的一种广谱的二萜烯类抗生素，主要对革兰阳性菌和支原体有活性作用[1]。为寻找抗耐药菌的超级抗生素，本研究拟对已合成出的C-14位处侧链上带有杂环的一系列新型截短侧耳素衍生物，进行系统抗菌活性测试，为临床应用提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与菌株 阿莫西林（山东淄博新达制药有限公司，批号101224），泰妙菌素（江苏赛奥生化有限公司，批号110319），新型截短侧耳素衍生物15，16a和 16b（本实验室合成）。MRSE,MRSA,甲氧西林敏感的表皮葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus epidermids,MSSE)及甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌 (methicillin-susceptible Staphylococcus aureus,MSSA)菌株（临床标本分离菌株，由江苏南京鼓楼医院提供），MH培养基(北京三药科技开发公司，批号110217)；MH肉汤(北京陆桥技术有限责任公司，批号110321)。

1.2 仪器 TDR-200B型自动微生物鉴定系统 (湖南长沙天地人生物科技有限公司)；DL-CJ-1F实验医用型洁净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司北京分公司)；DH3600AB型电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；一次性使用培养板(江苏姜堰市天力医疗器械有限公司，批号：20090218)。

1.3 方法

1.3.1 药液的制备:采用微量肉汤二倍稀释法[2]：取8排12孔的一次性使用培养板，分别标记，在标号1～12孔中各加入MH肉汤培养液100 μL，在每排的第1 孔各加入原药液 100 μL(50 μg·mL-1)，将第 1 孔混匀后，抽取100 μL加入第2孔，将第2孔混匀后再抽取100 μl加入第3孔，依次倍比稀释至第10孔，将第10孔混匀后抽取100 μL弃去，第11、12孔分别作阳、阴性对照。1～10孔中药液浓度依次为：25．00、12．50、6．25、3.13、1.57、0.79、0.39、0.20、0.10、0.05 μg·mL-1。

1.3.2 菌液的制备:从已分离纯化并过夜新鲜培养的细菌平板上挑取4～5个菌落，接种于MH肉汤中增菌6 h。菌液用3 mL MH肉汤以比浊仪校正浊度至 0.5 McFarland，再用 MH肉汤稀释至 1.5×105cfu·mL-1，作为试验菌液。

1.3.3 MIC的测定:用微量加样器取100μL MRSA菌液，依次加入上述培养板第1～11孔中，使最终接种量为 5×105cfu·mL-1，37℃恒温培养 18～20 h，观察细菌生长情况，培养液澄清的为阴性 (即无细菌生长)，混浊的为阳性（即有细菌生长）。以无菌生长96孔平板的最低药物浓度为该药对该株细菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)。

2 结 果

阿莫西林对金黄色葡萄球菌的MIC值为4μg·mL-1，而新型截短侧耳素衍生物15，16a,16b对金黄色葡萄球菌的MIC值均小于1μg·mL-1，抑菌效果明显优于阿莫西林,见表1。

表1 新型截短侧耳素衍生物对金黄色葡萄球菌 MIC 值（μg·mL-1）

新型截短侧耳素衍生物15，16a,16b对表皮葡萄球菌的最低抑菌浓度也明显小于阿莫西林，且对MSSE和MRSE的MIC值相同，见表2。

表2 新型截短侧耳素衍生物对表皮葡萄球菌 MIC 值（μg·mL-1）

3 讨 论

截短侧耳素具有良好的抗菌活性，1951年Kavanagh等[3]首次发现、定义并分离了这种结晶状抗菌物质，把它命名为Pleuromutilin。1974年Sandoz研究所在截短侧耳素的基础上，经过半合成生成了高活性的动物专用抗生素泰妙菌素(Tiamulin)，其水溶性和抑菌效果均较截短侧耳素有较大提高，对志贺菌、克雷伯菌以及大肠埃希菌显示较强活性，并被推荐为控制猪支原体感染首选药物[4]。随着全球滥用抗生素的趋势越来越严重，耐药菌感染引起的疾病引起科学家的极大重视，2007年葛兰素公司以截短侧耳素为原料开发出了第一个人用截短侧耳素类抗生素瑞他莫林(Retapamulin)，用于治疗金葡萄球菌或化脓性链球菌引起的脓疱疮[5-6]，该药已于2008年在美国成功上市，商品名为Altargo，这是第一个人用截短侧耳素衍生物，标志着此类抗生素实现了从兽用到人用的飞跃。

随着抗菌药物的广泛应用，出现了大量的临床耐药致病菌。MRSA和MRSE都是医院感染的重要致病菌，由于对多种抗菌药物产生耐药性,它导致的各种感染治疗困难，病死率较高，因此，研究探索抗MRSA和MRSE的有效药物已势在必行。为了提高截短侧耳素的水溶性和抑菌效果，本实验室合成了C-14位处侧链上带有杂环的一系列新型截短侧耳素衍生物，并对这些衍生物进行体外抗菌活性测定。结果显示，新型截短侧耳素衍生物15,16a,16b对MRSE、MRSA、MSSE和 MSSA均有较强的抑菌作用，最低抑菌浓度明显小于阿莫西林和泰妙菌素，且新型截短侧耳素衍生物15,16a对MRSA的MIC低于MSSA。我们还发现新型截短侧耳素衍生物15,16a,16b对MSSE和MRSE的抑菌效果几乎一样，这可能给MRSE引起的感染提供了一种新的治疗药物，为今后合成抗菌作用更强的新型截短侧耳素衍生物打下基础。

[1]吴雪萍，孙凤霞，苏为科,等．截短侧耳素的HPLC测定[J]．河北科技大学学报，2008，29（1）：53-56.

[2]Murray PR，Baron EJ，Pfaller MA，et al．Antibacterial susceptibility tests：dilution and disk diffusion methods．Manual of clinical microbiology[M]．9th ed．Washington DC：ASM Press，2007：1110-1117．

[3]黄宇琪，张怡，胡昌华．截短侧耳素产生菌的鉴定及发酵培养基初筛 [J]．四川大学学报 (自然科学版)，2008，45（3）：699-702.

[4]Hunt E.Pleuromutilin antibiotics[J].Drugs Fut,2000,25(11):1163-1168.

[5]刘党生译.治疗人革兰阳性球菌皮肤感染的截短侧耳素类抗生素Retapamulin[J]．国外医药:抗生素分册，2008，29（1）：28-31．

[6]Ronald N，Jones RN,Thomas R,et al.Activity of retapamulin(SB-275833),a novel pleuromutilin,against selected t resistant gram-positive Cocci cocci[J]．Antimicrob Agents Chemother,2006,50(7)：2583-2586．