植物乳杆菌大米发酵条件的优化

周显青，陶华堂，王学锋

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

中国传统食品工业和现代化是振兴民族食品工业、发展中国特色的现代食品工业的必要途径.传统食品工业化的研究已引起了广泛重视[1].米粉(Rice Noodles)是以大米为原料制成的条状或片状产品，属大宗农产品深加工的主要产品之一，在我国及东南亚具有广阔市场[2].发酵可使大米粉的化学成分发生显著变化，进而对大米粉的理化特性和最终产品的品质产生影响，其食味品质有较大改善，表现为更加柔韧筋道.发酵过程中，微生物的产酸和酶对米粉品质改善影响较大.目前，对发酵过程中菌种的作用效果的研究还较少，大部分研究集中在自然发酵上，其发酵后米粉产品仍然存在安全性及质量稳定性等问题，因此，寻找大米适宜的改性方法来提高米粉的品质已成为重要的研究课题[3].为此，作者采用了植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）纯种发酵[4].植物乳杆菌是同型发酵乳酸菌，在发酵过程中只产生乳酸，是典型的兼性厌氧菌，有很强的发酵碳水化合物的能力，较耐盐[5].利用微生物发酵生产各种有用代谢产物，其培养基成分种类繁多，各成分间的相互作用也错综复杂.因而，微生物培养条件的优化就显得尤为重要.多种优化方法已开始广泛地应用，其中以响应面法的效果最为显著.响应面法是综合试验分析和数学建模最经济合理的试验设计方法[6].常用于描述单个试验变量对响应值的影响、确定试验变量之间的相互关系、描述所有试验变量对响应值的综合影响，弥补了以前在微生物培养基优化方面的不足.作者在单因素试验的基础上，用最陡爬坡路径逼近最大响应区域，再用Box-Behnken试验设计及响应面分析法进行回归分析，获得了植物乳杆菌发酵大米的较佳条件，为提高米粉条(片)的品质及技术改进提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料

植物乳杆菌CGMCC 1.555菌株由中国工业微生物菌种保藏中心提供.籼碎米：2011年产于河南省信阳.

脱脂乳培养基：脱脂奶粉120 g/L，蒸馏水配制，混匀后分装，115℃蒸气灭菌30 min.

MRS培养基：酪蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物10.0 g/L，酵母提取物 5.0 g/L，葡萄糖 5.0 g/L，乙酸钠5.0 g/L，柠檬酸二铵2.0 g/L，Tween-80 1.0 g/L，K2HPO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO35.0 g/L（配固体培养基时另加琼脂15.0 g/L），蒸馏水配制，调 pH 6.8，121℃蒸气灭菌20 min.

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2F型双人双面净化工作台：苏州净化设备有限公司；FA1204B电子天平：上海精密科学仪器有限公司；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；PYX-DHS-40X50隔水式电热恒温培养箱：上海跃进医疗器械厂；显微镜：日本尼康公司；101FAR-1型电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与增殖

将保存于实验室的植物乳杆菌接种到灭过菌的脱脂乳培养基中，在30℃下培养48 h.待脱脂乳培养基胨化后，再将植物乳杆菌接种到新鲜的脱脂乳培养基中培养.待菌体生长稳定后，再将植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在30℃下培养48 h.取出斜面培养基，用接种环在无菌条件下挑取植物乳杆菌单菌落，接种到MRS液体培养基中，在30℃下培养24～48 h.取对数期菌种的纯培养物，加20%甘油在-70℃下保藏菌种.平板、斜面培养基的菌种见图1、图2，显微镜下的菌种见图3.

图1 平板菌落

图2 斜面培养基的菌种

图3 植物乳杆菌显微照片

1.3.2 菌悬液的配制

把活化增殖培养后的植物乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在30℃下培养24～48 h，直至乳酸菌的浓度达到5×108cfu/mL，此菌悬液的照片见图4.

图4 菌悬液

1.3.3 大米发酵条件的优化

参照文献［7-8］发酵条件，取大米150 g，用蒸馏水冲洗后放入已灭菌的装有无菌水的三角瓶中，大米与无菌水的比例为 1∶2（M/V）.吸取上述菌悬液接种到三角瓶中，密封后，分别在不同条件下发酵培养.

1.3.3.1 培养温度对植物乳杆菌生长的影响

按3.3%(V/V)的接种量取10 mL菌悬液接种，然后把培养基的初始pH值调整为7.0，分别在22、27、32、37、42 ℃下密封培养，用平板菌落计数记录菌体浓度的变化[9]，每天取样1次，连续测定7 d.每个处理做3个重复，取平均值，以确定菌种最适生长温度.

1.3.3.2 初始pH值对植物乳杆菌生长的影响

按3.3%(V/V)的接种量取10 mL菌悬液接种，然后把培养基的初始pH值分别调整为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在 37℃的条件下密封培养，用平板菌落计数记录菌体浓度的变化，每天取样1次，连续测定7 d.每个处理做3个重复，取平均值，确定菌种最适初始pH值.

1.3.3.3 接种量对植物乳杆菌生长的影响

按 2%、3%、4%、5%、6%(V/V)的接种量将菌悬液接入到三角瓶中，然后把培养基的初始pH值调整为7.0，在37℃的条件下密封培养，用平板菌落计数记录菌体浓度的变化，每天取样1次，连续测定7 d.每个处理做3个重复，取平均值，确定菌种最适接菌量.

1.3.3.4 响应面分析优化

单因素试验分别对培养温度、起始pH、接种量对植物乳杆菌的菌体生长情况进行了考察，根据Box-Behnken中心组合设计原理，以菌体浓度为响应值，以培养温度、起始pH、接种量为变量.参照文献［10］，利用Design-Expert 7.1.6软件设计旋转中心组合试验，共15组，其中12个为析因点，3个为零点以估计误差，重复3次.

2 结果与分析

2.1 培养温度对菌种的影响（表1）

表1 培养温度对植物乳杆菌生长的影响 lg(C/(cfu·m L-1))

温度对发酵液中的菌体生长速率有显著影响.温度对微生物生长的影响包括：一是影响细胞膜的流动性从而影响微生物对营养物质的吸收和代谢产物的产出；二是温度主要通过改变酶反应速率来影响微生物的生长，一般情况下随着培养温度的升高酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前.但酶本身很容易因为过热而失去活性，表现为菌体衰老，最终影响产量，所以研究温度对菌体生长的影响非常必要.由表1可知，从每天的发酵来看，随着温度的升高，活菌数都是先增加后减小，不同温度的活菌数含量存在显著差异（除第4天外），且都是在37℃时活菌数最高.这表明在37℃时植物乳杆菌的代谢最活跃，分裂最旺盛.从每个恒定的温度来看，随着发酵天数的增加，菌体的浓度都是先增加后减小，且在第3天时达到最大.由此可知，植物乳杆菌的最适生长温度为37℃，发酵3 d时菌体最活跃.此时，菌种的活性最大，对大米中的碳水化合物的发酵能力最强，在此条件下发酵的大米做出来的米粉外观洁白透亮，黏弹性较好，而且还有一定的米香味，长时间发酵的大米有酸味或者腐臭味.

2.2 初始pH值对菌种的影响（表2）

培养基pH值对微生物的生长有显著影响，pH值对菌体细胞膜的电荷情况产生直接影响，进而直接制约着菌体对营养物质的吸收.pH值的变化会影响各种酶活，从而影响菌体的生长.培养基初始pH值的变化还会影响接种后菌体生长的延迟期和生长速率以及产物的合成，进而最终影响到菌体发酵大米的能力.由表2可知，从每天的发酵来看，随着pH的增加，活菌数都是先增加后减小，且都是在pH 7.0时活菌数最高.随着发酵天数的增加，菌体的浓度先增加后减小，同一培养时间中，不同的起始培养pH值对植物乳杆菌具有较大的影响，组间组内差异显著，且在第3天时菌体浓度达到最大.由此确定，植物乳杆菌的最适pH为7.0，发酵3 d时菌体最活跃.此时植物乳杆菌对大米的发酵利用达到了最佳，发酵出来的米粉品质也较好.

2.3 接种量对菌种的影响（表3）

接种量直接制约着植物乳杆菌对大米的发酵程度.当接菌量较大时，微生物能充分利用营养物质从而缩短生长的延迟期，但与此同时会使微生物生长过快，消耗大量的营养物质，反而影响后期的生长.接种量较小会使微生物的生长速度变得缓慢，使发酵液中含菌量过低，培养时间延长，不符合经济利益.因此接种量的多少应该根据实际情况而定.由表3可知，在发酵第1天，菌体浓度随着接种量的增大而增大；从发酵第2天开始，随着接种量的增加，菌体的浓度都是先增加后减小，且都是在接种量5%时菌体的浓度最高，随着发酵的天数增加，菌体的浓度先增加后减小，不同接种量间的活菌数含量存在显著差异，且在第3天时菌体浓度达到最大.由此确定，植物乳杆菌的最佳接种量为5%，发酵3 d时菌体最活跃.对大米的发酵较充分，发酵出来的米饭品质的口感也较好.

表2 起始pH对植物乳杆菌生长的影响 lg(C/(cfu·m L-1))

表3 接种量对植物乳杆菌生长的影响 lg(C/(cfu·m L-1))

2.4 响应面法优化植物乳杆菌的发酵条件

2.4.1 用响应面法确定最佳值域

按1.3.3中的试验方法，运用响应面设计法对植物乳杆菌发酵条件进行寻优，试验因素设计见表4，试验方案及结果见表5.

2.4.2 二次回归拟合及方差分析

利用Design-Expert 7.1.6软件对表5的响应面结果进行多元回归拟合，得到的模型为多项回归方程.选择对响应值影响显著的各项，得到多项回归方程：Y=1 110.33-20.25A+31.00B-31.75C+166.00

AB+40.00AC-100.00BC-125.17A2-107.17B2-23.17C2.为了检验方程的可靠性，对该方程进行显著性验证和方差分析，结果见表6.

由表6可知，显著性水平P=0.005 4，表明该模型影响显著，植物乳杆菌在不同发酵条件下的差异显著.失拟项P=0.674 1>0.05，表明失拟项不显著，模型的预测值与实际值拟合效果很好.模型的相关系数R2=96.01%，大于90%，说明菌体浓度与培养温度、起始pH和接种量存在线性相关，表明该模型可解释菌体浓度的变化.因此该回归方程可以较好地描述各因素与响应面之间的真实关系，可利用该回归方程预测发酵条件对菌体浓度的影响.

表4 Box-Behnken中心组合设计

表5 Box-Behnken设计方案及响应值结果

表6 二次回归模型的方差分析结果

2.4.3 采用快速“等高法”寻最优值

在回归模型方差分析的基础上，利用软件对试验数据进行响应面优化分析，考察所拟合的对应曲面形状，培养温度、起始pH和接种量对菌体浓度影响的等高线和相应的响应面如图5—图7所示.等高线的形状反映交互效应强弱的大小，圆形表示两交互作用不显著，椭圆形表示两交互作用显著[10].

根据响应曲面所具有的特性，在尽可能减少试验次数的条件下，利用快速“等高法”既能改善现有试验水平，又甚至接近最优点[11]；它仅需要一个上升方向的估算，而不需要精确计算整个曲面，因此可以大大减少试验次数.

2.4.3.1 起始pH和培养温度对菌体浓度的影响由图5可知，当接种量取零点值时，随着起始pH的增加，培养温度对植物乳杆菌的菌体浓度的影响是先增加后减少，且有最大值；同理随着培养温度的增加，起始pH对植物乳杆菌的菌体浓度的影响也是先增加后减少，且有最大值，起始pH与培养温度分别在7.0左右和37℃左右达到最大值.且起始pH与培养温度的等高线近似椭圆形，所以起始pH与培养温度交互作用较显著.

2.4.3.2 接种量和培养温度对菌体浓度的影响

由图6可知，当起始pH取零点值时，随着接种量的增加，培养温度对植物乳杆菌的菌体浓度的影响是先增后减，且有最大值；同理随着培养温度的增加，接种量对植物乳杆菌的菌体浓度的影响也是先增后减，且有最大值，接种量与培养温度分别在5%左右和37℃左右达到最大值，且接种量和培养温度的等高线接近圆形，可见，接种量与培养温度交互作用不太显著.

2.4.3.3 接种量和起始pH对菌体浓度的影响

由图7可知，当培养温度取零点值时，随着接种量的增加，起始pH值对植物乳杆菌的菌体浓度的影响是先增后减，且有最大值；同理随着起始pH值的增加，接种量对植物乳杆菌的菌体浓度的影响也是先增后减，且有最大值，接种量与起始pH分别在5%左右和7.0左右达到最大值，且接种量和起始pH的等高线近似椭圆形，可见，接种量和起始pH交互作用较显著.

2.4.3.4 优化结果

由图5—图7可知，响应面的开口都向下，均存在极大值.由软件处理后可得优化结果：培养温度38.01℃，起始pH 7.25，接种量 4.03%，此时菌体浓度达到理论最大值1 156.51×105cfu/mL.

2.5 验证试验

用植物乳杆菌在此条件下发酵大米：培养温度38℃，起始pH 7，接种量4%时，对理论值进行验证，此时菌体浓度可达到最大值1 148×105cfu/mL，与理论值相符.此时的米粉洁白透亮，有较好的黏弹性，筋道且有咬劲，食用品质较好.培养条件优化后，得到的活菌数是基础培养基的1.2倍.

图6 接种量和培养温度的交互作用对菌体浓度的影响

图7 接种量和起始pH的交互作用对菌体浓度的影响

3 结论

在单因素试验的基础上，通过响应面优化和试验验证，获得植物乳杆菌发酵大米的最适宜条件：培养温度38℃，起始pH 7，接种量4%时，此时菌体浓度可达到最大值1 148×105cfu/mL，与理论值相符，得到的活菌数是基础培养基的1.2倍.

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