人参皂苷Rb1对油酸诱导HepG2细胞脂肪堆积的影响作用

陈 静，祁东利，张春风，陈 平，杨中林*

(1.中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏南京210009;2.武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北 武汉430023)

脂肪性肝病包括酒精性脂肪肝病(AFLD)和非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver diseases，NAFLD)两大类，其中，NAFLD在临床上更为常见，是一种严重影响人们生活质量的常见隐匿性肝病。目前NAFLD的临床治疗药物有胰岛素增敏剂、减肥药、调脂药、降压药、抗氧化剂、细胞保护剂、抗炎细胞因子等类型。由于近年来NAFLD的发病率逐年升高，发病机制未完全清楚，药物治疗也不完善，因此寻找良好的预防和治疗非酒精性脂肪肝病的药物尤为迫切。

人参皂苷Rbl是人参和竹节参的代表成分之一，属达玛烷型三萜皂苷类化合物，具有多种生物活性，对心血管系统，中枢神经系统，免疫系统都具有改善调节作用［1］，同时又具有抗肿瘤［2］，改善记忆力［3］，改善性功能［4］等功效，但尚未见人参皂苷 Rb1对非酒精性脂肪肝病的研究报道。本研究即模拟临床上非酒精性脂肪肝病理特点，利用油酸诱导HepG2细胞形成具有明显脂滴增加特征的脂质堆积肝细胞模型，评价人参皂苷Rb1改善该细胞模型脂质堆积作用及降低细胞内TG含量作用，揭示其在防治脂肪肝方面的潜在价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株

人肝癌细胞株HepG2，中国药科大学国家新药筛选中心馈赠。

1.1.2 药物与试剂

人参皂苷Rb1(中国药品生物制品鉴定所，批号:110704－200921);高糖DMEM干粉培养基(美国Gibco公司，批号:991030);胎牛血清(FBS)(美国Hyclone公司，批号:NWC0388);胰蛋白酶(美国Gibco公司，批号:27250018);油酸(美国 sigma公司，批号:026K13971V);油红O(美国Sigma公司，批号:O0625);牛血清白蛋白(BSA)(瑞士Roche公司，批号:738328);TG试剂盒(北京北化康泰临床试剂有限公司，批号:006304);MTT(美国Amresco公司，批号:0793);Western及IP细胞裂解液(碧云天生物技术研究所);二甲基亚砜(DMSO)、异丙醇、乙醇(南京化学试剂有限公司，分析纯)。

1.1.3 仪器

JJ－CJ－1FD型洁净工作台(苏州市金净净化设备科技有限公司);XDS－1B型倒置光学显微镜(重庆光电有限公司);二氧化碳恒温培养箱(Thermo公司);MH－1型细胞板振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);RT－6000型酶标分析仪(深圳书社生命科学股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

HepG2细胞用含10%FBS的高糖DMEM培养液，在37℃、体积分数5%CO2的饱和湿度条件下培养，每3天用0.25%的胰蛋白酶消化细胞，按1∶3进行传代，取对数期的细胞用于实验。

1.2.2 MTT 法测 HepG2 细胞活力

将HepG2接种于96孔培养板中，每孔接种细胞约1万个，在37℃、体积分数5%CO2培养箱中孵育24 h后，设对照组和终浓度为300、250、200、150、100、50、10、5、1 μg·mL－1人参皂苷 Rb1 加药组，每组6个平行孔。继续培养24 h后，每孔加0.5 mg·mL－1MTT 溶液20 μL，继续培养4 h后取出，弃培养基，每孔加DMSO 150μL，在细胞振荡器上振荡10 min，酶标仪490 nm处测吸光度。根据吸光度计算细胞存活率，选择人参皂苷Rb1合适的给药浓度范围。

式中:A加药490nm为加药组吸光度;A对照490nm为对照组吸光度。

1.2.3 细胞内TG检测

蛋白吸附法配制油酸溶液［5］:70℃振荡水浴下将油酸溶于 0.1 mmol·L－1NaOH 中，配成 100 mmol·L－1的储存液;55℃振荡水浴下将上述储存液滴入10%BSA 的PBS 溶液中，配成浓度5 mmol·L－1的使用液，过滤除菌，－20℃冷冻保存，使用前55℃水浴15 min并冷却至室温。

将HepG2细胞接种于24孔板，孵育24 h后取出，设置对照组、模型组和不同浓度人参皂苷Rb1加药组，每组均设6个平行孔。对照组加含2%BSA的1%FBS高糖DMEM培养基，模型组每孔加含终浓度1 mmol·L－1油酸的1%FBS高糖 DMEM 培养基，各加药组加含终浓度1 mmol·L－1油酸和各浓度(5、10、25、50、75、100、150 μg·mL－1)人参皂苷 Rb1的1%FBS高糖DMEM培养基。将24孔板置于37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育24 h后去除培养液，用PBS轻洗两遍，再用Western及IP细胞裂解液充分裂解细胞，6 000 r·min－1离心 5 min，取上清液，用TG试剂盒测定TG含量，并计算各加药组对TG的清除率。

式中:A模型为模型组吸光度;A加药为加药组吸光度。

1.2.4 油红O染色

油红O工作液配制［6］:油红O溶于异丙醇配成0.5%油红O贮备液，以6∶4的比例将贮备液与蒸馏水混匀后过滤2次，至液体澄清为止，得油红O工作液。

将HepG2细胞接种于24孔板，孵育24 h后取出，分为对照组、模型组、低中高浓度(10、50、100 μg·mL－1)人参皂苷Rb1加药组，各组所加培养基同“1.2.3”项下所述。继续孵育24 h后去除培养液，油红O工作液对各组细胞染色30 min，蒸馏水洗两次，在倒置显微镜下观察染色效果。

1.2.5 统计分析

通过Excel软件对数据进行分析、作图，实验结果以平均值±标准误差)表示，采用t检验法比较组间差异，p＜0.05具有显著性差异，p＜0.01具有极显著性差异。

2 结果

2.1 人参皂苷Rb1的细胞毒理学评价

高浓度的人参皂苷Rb1具有一定的细胞毒性，本实验通过MTT法检测人参皂苷Rb1对HepG2细胞存活率的影响，选取对细胞毒害作用较小的人参皂苷Rb1浓度作为实验的加药浓度。

表1 人参皂苷Rb1对HepG2细胞活力与存活率影响，n=6)

表1 人参皂苷Rb1对HepG2细胞活力与存活率影响，n=6)

组别 浓度(μg·mL－1) A490 nm 存活率对照组 －1.122 ± 0.039 100%1.129 ± 0.124 100.6%5 1.111 ±0.076 99.0%10 1.094 ± 0.047 97.5%50 1.073 ± 0.040 95.6%100 1.034 ± 0.027 92.2%150 1.013 ± 0.046 90.3%200 0.955 ±0.080 85.1%250 0.890 ± 0.045 79.3%1人参皂苷Rb1给药组300 0.847 ± 0.052 75.5%

如表1所示，随着人参皂苷Rb1浓度的增加，细胞存活率逐渐降低，说明人参皂苷Rb1对HepG2细胞有一定的毒害作用。当其浓度小于150μg·mL－1时，细胞存活率在90%以上，对细胞毒害作用很小，因此人参皂苷Rb1的给药浓度可设定在1～150 μg·mL－1之间。

2.2 人参皂苷Rb1对HepG2细胞TG含量的影响

实验选取了对细胞毒害作用较小的人参皂苷Rb1系列浓度，测定该系列浓度下人参皂苷Rb1对HepG2细胞脂肪堆积模型TG含量的影响作用。

表2 人参皂苷Rb1对TG含量的影响n=6)

表2 人参皂苷Rb1对TG含量的影响n=6)

注:△△△P ＜0.001，与对照组比较;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01，＊＊＊P ＜0.001，与模型组比较

清除率对照组组别 浓度(μg·mL－1)1 000万细胞TG含量(mg)TG 1.298 ±0.037 －模型组 － 6.630±0.036△△△ 100%－5人参皂苷Rb1给药组30.8%6.878 ±0.029 －3.7%10 6.602 ±0.030 0.4%25 6.271 ±0.026 5.4%50 5.387 ±0.021* 18.7%75 5.055 ±0.029* 23.8%100 4.116 ±0.022＊＊＊ 37.9%150 4.586 ±0.029＊＊

图1 人参皂苷Rb1对TG含量的影响

如表2和图1所示，模型组与对照组相比，TG含量显著增加，具有极显著性差异(p＜0.001)，表明HepG2细胞脂肪堆积模型成功建立。150μg·mL－1和100 μg·mL－1人参皂苷 Rb1 组与模型组相比，TG含量具有极显著性差异(p＜0.01);75μg·mL－1和 50 μg·mL－1人参皂苷 Rb1 组与模型组相比，TG含量具有显著性差异(p＜0.05)，并且在5～100μg·mL－1浓度范围内随人参皂苷Rb1浓度的升高，对细胞内TG的清除率也逐渐升高，表现出较明显的剂量依赖性，其中100μg·mL－1人参皂苷Rb1组降低细胞内TG的作用最强，对TG的清除率达37.9%。

2.3 人参皂苷Rb1减轻细胞内脂质堆积的作用

倒置显微镜对油红O染色的细胞进行形态学观察(图2)，结果显示，与对照组相比，模型组细胞出现大量红色脂滴，脂滴数量非常多，并发生相互融合现象，说明HepG2细胞脂肪堆积模型成功建立。随着人参皂苷Rb1浓度的增加，HepG2细胞红色脂滴数量呈现减少的趋势，且脂滴变小，颜色变浅。低中高浓度人参皂苷 Rb1组中，低浓度组(10μg·mL－1)的效果差，与模型组差异不大;中浓度(50μg·mL－1)组改善细胞内脂质堆积较明显，相较于模型组，减轻了细胞内脂质相互融合的现象;高浓度(100μg·mL－1)组可显著减轻细胞内脂质堆积现象，脂滴数量明显减少，颜色也明显变浅。

通过人参皂苷Rb1对细胞内TG含量影响和改善脂肪堆积现象可知，人参皂苷Rb1具有良好的体外降脂活性，提示其有一定的防治脂肪肝的作用。

图2 各组细胞染色图

3 讨论

自1958年首次正式报道非酒精性脂肪肝病(NAFLD)至今，NAFLD已经成为全球范围内普遍存在并日趋严重的疾病，目前全球的平均发病率大约20%左右，并呈逐年增加趋势。NAFLD是世界范围内导致肝功能异常的主要原因，其典型特征是肝脏脂肪积聚。甘油三酯是NAFLD患者肝脏内蓄积的主要脂质，它的积聚是合成与转化失衡的结果［7］。NAFLD的发病目前尚不能以单一的机制解释，一般认为它是一种遗传－环境－代谢应激相关性疾病，人们广泛接受的理论是Donati和Diehl等提出的“二次打击”学说［8］。

目前国内外对脂肪肝的研究主要采用动物模型，细胞模型研究较少。由于动物模型存在个体差异较大、实验条件不易控制、整体影响因素多、材料耗费多、研究周期长且稳定性较差等不利因素，因此成功建立稳定的细胞模型可很好的克服上述缺点，并且能针对性地探究NAFLD发病的细胞机理。

HepG2细胞易于培养，细胞特性稳定，并已成功用于脂肪肝细胞模型的建立，在细胞水平上筛选脂肪肝防治药物或探讨脂肪肝的病理机制。长链脂肪酸能使HepG2细胞形成明显的脂滴，进而引起HepG2细胞脂肪堆积。在游离脂肪酸中含量最高的是油酸，因此可选择油酸诱导建立肝细胞脂肪堆积模型，它符合 NAFLD 形成的病理生理过程［9］。Yasuyuki等［10］用1 mmol·L－1的油酸诱导HepG2细胞24 h后，成功建立肝细胞脂肪堆积模型;Cui等［11］采用油酸诱导HepG2细胞24h，采用比色定量法研究发现细胞内脂肪堆积程度与油酸浓度(0.1－2 mmol·L－1)呈正相关。

本实验模拟NAFLD的发病过程，选用油酸做造模剂，诱导HepG2细胞24 h成功建立脂肪堆积模型，并选择NAFLD的常规检测指标(TG含量、脂滴量)评价人参皂苷Rb1对细胞内脂肪堆积的作用。实验结果表明，100μg·mL－1人参皂苷 Rb1组作用最显著，其TG含量与模型组比较，具有极显著性差异(p＜0.01)，对细胞内TG的清除率达37.9%，并且人参皂苷Rb1在5～100μg·mL－1的浓度范围内表现出较明显的剂量依赖性。因此人参皂苷Rb1具有良好的降脂作用，在脂肪肝防治方面具有潜在药用价值，但目前人参皂苷Rb1的降脂机制还不十分明确，具体的机制有待于进一步实验探讨。

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［3］ 陈声武，王丽娟，王岩，等.人参皂苷Rb1和Rd对不同类型记忆障碍模型小鼠学习记忆功能的影响［J］.中国药理学与毒理学杂志，2001，15(5):330 －332.

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