菠萝蜜蛋白酶提取方法的比较研究

徐志霞，黄偱吟，纪明慧，陈贤珍，卞先蓉，郭宇秀，王锐萍，*

(1.海南师范大学生命科学学院，海南海口571158;2.海南师范大学化学化工学院，海南海口571158)

菠萝蜜(Artoarpus heterophyllus Lam)，又称树菠萝、木菠萝，原产印度和马来西亚，目前在我国的海南、广东、广西、台湾、福建等地均有种植。菠萝蜜树株产果实可达百千克，且果实硕大，重5～35kg，其营养价值很高，含有碳水化合物、糖分、蛋白质、淀粉、维生素、氨基酸以及对人体有用的各种矿物质［1］。其中菠萝蜜的果皮、果肉和种子中粗蛋白质量分数分别为鲜质量的4.24%、2.43%、10.49%，而且菠萝蜜果实中的蛋白质含量是其它常见水果的2～8倍。目前菠萝蜜的价值并没有得到广泛的开发利用，缺乏成熟的配套技术，除果肉和种子作为食品开发外，菠萝蜜的经济效益不高，制约了菠萝蜜产业的发展。菠萝蜜蛋白酶表现出对酪蛋白较高的水解活性，可用于肉的嫩化、啤酒的澄清等日化行业中，在医学上可作抗水肿和消炎药物，口服可加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织中的纤维蛋白及血凝块溶解［2］。若对菠萝蜜蛋白酶进行开发利用，则可大大丰富植物蛋白酶市场，这对于促进菠萝蜜种植业与加工业的发展具有重要的意义。蛋白酶的提取方法很多，如盐析法、层析法、电泳、超滤等技术，本研究以菠萝蜜果肉为材料，选择工艺较简单的乙醇法、硫酸铵沉淀法和氯化钠沉淀法进行研究和比较，为工业化生产及进一步推广应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝蜜(Artoarpus heterophyllus Lam) 海南产，本研究取材于成熟果实的果肉部分;乙醇、硫酸铵、氯化钠、酒石酸钾钠、三氯醋酸、磷酸氢二钠、柠檬酸、酪蛋白 均为国产分析纯。

TDL-40B台式低速大容量离心机 湖南新科科学仪器有限公司;7200型可见分光光度计、UV-2000型紫外可见分光光度计 龙尼柯上海仪器有限公司;马头牌JYT-2架盘药物天平 上海医用激光仪器厂;HH-W600数显三用恒温水箱 金坛市金南仪器制造有限公司;UB-10型酸度计 丹佛仪器(北京)有限公司。

1.2 测定方法

1.2.1 蛋白质含量的测定 采用双缩脲法。标准曲线的制作参照参考文献［3］，所得吸光度(y)与蛋白质含量(x)的标准曲线回归方程为:y=8.10993e-4+0.10243x，即 x=9.7599y-0.0076(r=0.9997)。

1.2.2 菠萝蜜蛋白酶活力测定［4］菠萝蜜蛋白酶活力单位定义:在测定条件下，每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μg酪氨酸在275nm处光吸光值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位。

测定方法为用酪氨酸和蒸馏水配制一系列不同浓度的酪氨酸溶液，于275nm处，测得吸光值制作标准曲线。得回归直线为:y=-0.0141+0.00698x，y表示为吸光度;x表示酪氨酸的最终浓度(μg/m L)。当x为50μg/m L 时，通过 y=-0.0141+0.00698x，得到y=As=0.335。计算公式如下:

式中:A表示所提出的蛋白酶在275nm处的吸光值;As表示50μg/L的标准酪氨酸在275nm处的吸光值(As=0.335);Ws表示标准酪氨酸的浓度(50μg/L);t表示反应时间(10m in);V表示酶催化水解的体积(4m L);N表示稀释倍数。

酶的比活力为酶活力单位与蛋白质毫克数的比值。

1.2.3 菠萝蜜蛋白酶得率的测定 本实验规定为各种方法在最佳条件下制取的菠萝蜜蛋白粉与所用菠萝蜜的质量分数比。

1.3 菠萝蜜蛋白酶的提取方法

新鲜菠萝蜜→取果肉用组织捣碎机捣碎→加入一定浓度的抽提液，在一定的pH、温度、时间下浸提→过滤→取上清4000r/min离心20min→取沉淀即得粗酶→测酶活。

1.4 提取菠萝蜜蛋白酶的单因素实验

菠萝蜜蛋白酶提取工艺的影响因素主要包括提取液浓度、pH、提取温度、提取时间，针对这四个因素，控制单一变量，考察其对菠萝蜜蛋白酶活力的影响。

1.5 提取菠萝蜜蛋白酶的正交实验［5］

在不同提取方法的单因子实验基础上设计正交实验，以菠萝蜜蛋白酶的比活力为指标，优选最佳工艺。乙醇法、硫酸铵沉淀法、氯化钠沉淀法的正交实验方案见表1～表3。

表1 乙醇法提取菠萝蜜蛋白酶L25(54)正交实验方案Table 1 The design of L25(54)orthogonal testmethod of alcohol

表2 硫酸铵沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶L25(54)正交实验方案Table 2 The design of L25(54)orthogonal testmethod of ammonium sulfate precipitation

表3 氯化钠沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶L9(34)正交实验方案Table 3 The design of L9(34)orthogonal testmethod of sodium chloride precipitation

2 结果与分析

2.1 乙醇法提取菠萝蜜蛋白酶

用组织捣碎机将菠萝蜜果肉捣碎，称取20g菠萝蜜样品，按照1.3实验方法进行提取，确定各单因素提取菠萝蜜蛋白酶的最佳条件为(结果未列出):乙醇提取浓度80%，pH7.2，温度42℃，时间20min。在此基础上进行正交实验，正交实验结果与分析见表4。

表4 乙醇法提取菠萝蜜蛋白酶正交实验结果Table 4 The results of orthogonal testmethod of alcohol

从表4可以看出，在乙醇浓度升高时，随着时间的延长，蛋白酶的活性显著降低，可能是此时大部分的蛋白酶已经变性。根据表4可知，4个因素对乙醇法提取菠萝蜜蛋白酶比活力影响的主次顺序为:提取时间＞pH＞温度＞乙醇浓度，最佳工艺组合为A1B1C1D1，即 10%浓度乙醇中，10℃条件下，浸提10min，最佳pH为5.0。

2.2 硫酸铵沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶

用组织捣碎机将菠萝蜜果肉捣碎，称取10g菠萝蜜样品，按照1.3实验方法进行提取，确定各单因素提取菠萝蜜蛋白酶的最佳条件为(结果未列出):硫酸铵提取浓度17.5%，pH6.0，温度0℃，时间35min。在此基础上进行正交实验，正交实验结果与分析见表5。

表5 硫酸铵沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶正交实验结果Table 5 The result of orthogonal test method of ammonium sulfate precipitation

从表5可以看出，pH对此方法的影响较大，最适p H为6.8，而温度和时间的影响不大，说明硫酸铵沉淀法提取的菠萝蜜蛋白酶的稳定性比较好。根据表5可知，4个因素对硫酸铵沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶比活力影响的主次顺序为:pH＞硫酸铵浓度＞温度＞时间，最佳工艺组合为A1B3C1D1，即15%浓度硫酸铵中，0℃条件下，浸提15min，最佳pH为6.8。

2.3 氯化钠沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶

用组织捣碎机将菠萝蜜果肉捣碎，称取10g菠萝蜜样品，按照1.3实验方法进行提取，确定各单因素提取菠萝蜜蛋白酶的最佳条件为(结果未列出):氯化钠提取浓度17.5%，p H5.5，温度4℃，时间60min。在此基础上进行正交实验，正交实验结果与分析见表6。

表6 氯化钠沉淀法提取菠萝蜜蛋白酶正交实验结果Table 6 The results of orthogonal test method of sodium chloride precipitation

根据表6结果显示，菠萝蜜蛋白酶的最适pH在5～6之间，低温时操作有利于保护蛋白酶的活性。由表6可知，4个因素对氯化钠法提取菠萝蜜蛋白酶比活力影响的主次顺序为:氯化钠浓度＞温度＞pH＞提取时间，最佳工艺组合为A1B2C2D2，即17.5%浓度氯化钠中，4℃条件下，浸提2h，最佳p H为6.0。

2.4 乙醇、硫酸铵、氯化钠法提取菠萝蜜蛋白酶的比较

由表7可以看出，用硫酸铵沉淀法提取的菠萝蜜蛋白酶得率和酶活力最高，其中得率达57.18%，分别比乙醇法和氯化钠沉淀法高出50倍和25倍，而比活力也比乙醇法和氯化钠法高，所以用硫酸铵沉淀法进行菠萝蜜蛋白酶的提取效果比较好。研究发现，罗汉果蛋白酶的工业提取工艺中酶比活力最高为 2.52U/mg，得率为 52.32%［6］;生姜蛋白酶的工业提取工艺中酶比活力最高为4.383U/mg，得率为2.3%［7］;无花果蛋白酶的工业提取工艺中酶比活力最高为0.29U/mg，得率为47.99%［8］。而本研究中菠萝蜜蛋白酶的初步提取中，酶比活力最高为6.881U/mg，得率为57.18%，显著高于其他蛋白酶。

表7 三种提取方法的比较Table 7 Comparision of three extraction methods

3 结论与讨论

本课题组前期研究发现，在菠萝蜜的果肉、花萼、种子中，果肉提取的蛋白酶得率和酶活最高，因此本实验选取菠萝蜜果肉为实验材料。通过对三种方法的比较，硫酸铵沉淀法得率和酶活力较高，但是此工艺操作复杂，杂质较多不易去除，不适合大规模生产应用;氯化钠法和乙醇法提取蛋白酶的得率较低，酶活力相似，而氯化钠也不易去除，但乙醇比较容易去除，通过进一步的研究优化工艺，可以作为工业提取的有效方法。但是要在菠萝蜜产区进行粗酶的加工生产，由于目前还缺乏更多的有关规模化提取菠萝蜜蛋白酶的工艺技术，且本工艺还存在一些未完善的地方，因此有待进行更深入的研究。

［1］毛琪，叶春海，李应志，等.菠萝蜜研究进展［J］.中国农学通报，2007，23(3):439-443.

［2］焦凌梅.菠萝蜜营养成分与开发利用价值［J］.广西热带农业，2010(1):17-19.

［3］方焕，生吉萍.工业生产中木瓜蛋白酶的活性检测方法比较［J］.食品与机械，2000(6):27-29.

［4］舒薇，郭勇.木瓜凝乳蛋白酶的自水解作用及其对分离纯化的影响［J］.华南农业大学学报，2005，26(1):80-83.

［5］李春喜，姜丽娜，邵云，等.生物统计学［M］.北京:科学出版社，2005.

［6］苏小建，梁成钦，何星存，等.罗汉果蛋白酶的提取方法比较［J］.食品工业科技，2007，28(2):157-159.

［7］唐晓珍，黄雪松，乔聚林，等.生姜蛋白酶的工业提取方法比较［J］.无锡轻工大学学报，2003(2):20-21.

［8］郭冬青，纪付江，高健，等.无花果蛋白酶的不同提取方法比较及酶学性质研究［J］.湖北农业科学，2011(6):1258-1260.