七叶鬼灯檠挥发油及不同提取物抑菌活性的研究

王 健，黄 慧，王喆之，张 媛，*

(1.药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062;2.安康学院农学与生命科学院，陕西安康725000)

七叶鬼灯檠(Rodgersia aesculifoliaBatalin)为虎耳草科(Saxifragaceae)鬼灯檠属多年生草本植物，以根状茎入药，称作索骨丹［1］。七叶鬼灯檠药用历史悠久，作为我国传统的民间草药用于治疗跌打损伤、月经不调和风湿性关节炎等症［2-3］。目前国内外有关七叶鬼灯檠的研究主要集中在资源调查、化学成分分析及药理药效等方面。对于七叶鬼灯檠抑菌活性的研究，许多学者已经开展了一些有益的工作。七叶鬼灯檠的酸水解提取液对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌均有抑制作用，而醋酸乙酯、丙酮提取液则对肺炎克雷伯氏菌和胸膜肺炎杆菌等有一定的抑制作用［4］。胡振英等［5］研究了七叶鬼灯檠不同溶剂提取物对畜禽常见病原菌的抑制作用，结果表明丙酮和乙酸乙酯提取物的抑菌效果最显著。蔡正军等［6］对七叶鬼灯檠乙醇提取物及其五个萃取部位进行抑菌研究，发现乙醇提取物和乙酸乙酯萃取部位对受试菌均有较强的抑菌活性，在受试菌中对绿脓杆菌的抑制活性最强。韩建华等［7］研究发现七叶鬼灯檠对小麦赤霉病菌、玉米大斑病菌和辣椒疫霉病菌均有较强的抑菌活性，对菌丝生长的抑制率分别为68.31%、100%、88.76%，对受试菌孢子萌发抑制作用均达100%。由于同一植物不同提取部位对病菌的抑制程度不同，同一植物相同溶剂的提取物对不同的病原菌的抑制能力也有差异［8-9］，七叶鬼灯檠不同提取物的抑菌活性值得深入研究。为了更好的利用秦巴山区丰富的七叶鬼灯檠资源，本文采用滤纸片法和牛津杯法评价了七叶鬼灯檠根状茎的挥发油及其不同提取物对8种常见菌的体外抑菌活性，以期为开发新型植物源抑菌剂提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

七叶鬼灯檠于2008年10月初采自陕西户县，经陕西师范大学生命科学学院田先华教授鉴定为虎耳草科鬼灯檠属植物七叶鬼灯檠(Rodgersia aesculifoliaBatalin)。 白 色 葡 萄 球 菌 (Staphylococcus epidermidis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解脂假丝酵母(Candidalipolytica)、粘 红 酵 母 (Rhodotorula glatinis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 西安微生物所;肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae subsp.Pneumoniae)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis) 北京微生物所;二甲基亚砜、无水硫酸钠、甲醇、丙酮、乙酸乙酯 均为国产分析纯;盐酸四环素、制霉菌素 Wolsen公司;其他试剂均为国产分析纯。

TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;BS-1EA振荡培养箱 国华电器有限公司;FZ102微型植物粉碎机 黄骅市中兴有限责任公司;Q/BKYY31-2000型电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂;SL202N型药物电子天平 上海明桥精密科学仪器有限公司;超净工作台 苏州净化设备有限公司;RII旋转蒸发仪 瑞士BUCHI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 挥发油的提取［10］:将新鲜的七叶鬼灯檠根状茎自然阴干，粉碎，称取250g放入共水蒸馏装置中进行提取，提取时间6h，收集的挥发油用无水硫酸钠干燥，密封，4℃保存备用。

不同溶剂提取物的制备［11］:采用索氏提取的方法，用石油醚对七叶鬼灯檠根状茎粉末脱脂至无色，然后依次用乙酸乙酯、丙酮和甲醇分别索氏提取8h，将相应的提取物旋转蒸发回收溶剂，浓缩液用干燥箱烘干(45～50℃)，分别得七叶鬼灯檠根状茎的乙酸乙酯、丙酮和甲醇提取物。

1.2.2 七叶鬼灯檠根状茎挥发油及不同溶剂提取物的抑菌活性检测

1.2.2.1 培养基的制备 牛肉膏蛋白胨培养基(适用于细菌):精确称取蛋白胨10g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂 15～20g，配制 1000mL 培养基，调节 pH7.0～7.2，微波加热使充分溶解混匀，分装，121℃灭菌20min。

豆芽汁蔗糖培养基(适用于酵母):称取新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加蒸馏水煮沸约30min，用纱布过滤，然后定容至1000mL，再加入蔗糖50g，琼脂15～20g，煮沸熔化，分装，121℃灭菌 20min。

1.2.2.2 菌悬液的制备 菌种活化:取实验菌种在相应培养基斜面上活化。其中细菌在37℃培养24h(肺炎克雷伯氏菌30℃)，酵母菌在28℃培养48h。

菌悬液的制备:在无菌条件下，取活化的菌种用适量无菌生理盐水(0.9%)稀释，使菌悬液浓度为106～108CFU/mL。

1.2.2.3 样品溶液的制备 分别将甲醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物用二甲基亚砜配制成150mg/mL的溶液，同时配制浓度为0.5mg/mL盐酸四环素和制霉菌素的二甲基亚砜溶液作阳性对照。上述样品溶液皆用0.45μm滤膜过滤除菌。

1.2.2.4 七叶鬼灯檠根状茎挥发油的抑菌活性检测方法 采用滤纸片法［12］。将各菌种接种于牛肉膏蛋白胨培养基(酵母接种于豆芽汁培养基)，培养18～24h后，制备成浓度为106～107cfu/mL的菌悬液。取0.1mL菌液均匀涂布于平板上，取已灭菌的直径为6mm滤纸片，浸于15μL的挥发油(已用0.45μm滤膜过滤除菌)，贴于平板上，以盐酸四环素(细菌)和制霉菌素(酵母)作为阳性对照。4℃放置2h后，于37℃恒温培养24h(酵母在28℃恒温培养48h)。测其抑菌圈直径。实验重复3次。

1.2.2.5 七叶鬼灯檠根状茎不同溶剂提取物的抑菌活性检测方法 采用牛津杯法［12］。涂平板后，等距离放入3个灭菌的牛津杯(规格10mm×7.8mm×6mm)，逐一加入各样液50μL，分别以DMSO或PBS为阴性对照，以盐酸四环素(细菌)和制霉菌素(酵母)作为阳性对照。4℃放置2h后，细菌37℃恒温培养24h(酵母28℃恒温培养48h)。测量抑菌圈直径。实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 七叶鬼灯檠根状茎挥发油的抑菌活性分析

如表1所示，七叶鬼灯檠根状茎挥发油对表皮葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、白色葡萄球菌、酿酒酵母、粘红酵母和解脂假丝酵母具有不同强度的抑制作用。其中，对肺炎克雷伯氏菌抑制作用最强，抑菌圈直径达到(29.11±0.31)mm，其次为巨大芽孢杆菌，抑菌圈直径为(26.77±0.35)mm，抑菌活性均与阳性对照盐酸四环素相当(p＞0.05)。挥发油对表皮葡萄球菌的抑菌效果(抑菌圈直径为(22.67±0.61)mm)显著强于阳性对照盐酸四环素(p＜0.05)。七叶鬼灯檠根状茎挥发油对受试的3种酵母也有一定的抑制作用，其中对粘红酵母的抑菌作用最强，抑菌圈直径达到(26.20±0.24)mm，与阳性对照盐酸四环素相当(p＞0.05)。

2.2 七叶鬼灯檠根状茎不同提取物的抑菌活性分析

如表2所示，七叶鬼灯檠根状茎的甲醇提取物、丙酮提取物和乙酸乙酯提取物对表皮葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、肺炎克雷伯氏菌、白色葡萄球菌、粘红酵母、解脂假丝酵母具有不同强度的抑菌活性，而对酿酒酵母均未表现出抑制作用。其中，丙酮提取物的抑菌效果最强，对供试菌种(酿酒酵母除外)均有明显的抑菌效果，对解脂假丝酵母的抑菌活性最强，抑菌圈直径达到(25.10±0.52)mm，比阳性对照制霉菌素(抑菌圈直径为(23.82±0.09)mm)的抑菌效果更为显著(p＜0.05)。另外，对常见的呼吸道感染菌表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌的抑制效果也显著强于阳性对照(p＜0.05)，其抑菌圈直径分别达到(21.81±0.35)mm和(24.52±0.62)mm。甲醇提取物的抑菌效果相对丙酮提取物较弱，对解脂假丝酵母和表皮葡萄球菌的抑制作用较为明显，抑菌圈直径分别为(21.57±0.37)mm和(19.62±0.53)mm，与阳性对照相当(p＞0.05)。乙酸乙酯提取物的抑菌活性相对最弱，对供试菌种的抑菌活性普遍低于阳性对照(p＜0.05)，仅对肺炎克雷伯氏菌的抑菌作用相当于阳性对照盐酸四环素(p＞0.05)。

表1 七叶鬼灯檠根状茎挥发油的抑菌圈直径(n=3)Table 1 Diameter of inhibition zone of R.aesculifolia essential oil(n=3)

3 讨论

本实验对七叶鬼灯檠根状茎的挥发油及其不同溶剂提取物的抑菌活性进行了初步研究。结果表明，七叶鬼灯檠根状茎的挥发油对供试的8种菌均有较强抑菌活性，尤其对表皮葡萄球菌的抑制作用显著强于阳性对照。据报道鬼灯檠挥发油的化学成分较为复杂，包括多种脂肪酸类化合物、烷烃类化合物、萜类化合物、胺类化合物、醛酮类化合物，以及少量的芳香族化合物和氧化物［13］，其抑菌活性物质的分离鉴定以及抑菌机理还有待于进一步研究。另外，七叶鬼灯檠丙酮提取物和甲醇提取物均表现出较强的抑菌活性，其中丙酮提取物对常见的呼吸道感染菌表皮葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌有极强的抑制作用，抑菌效果优于阳性对照。由于七叶鬼灯檠丙酮提取物及其甲醇提取物的抑菌谱较广，抑菌作用强，可初步推测中等极性的丙酮提取部位和较大极性的甲醇提取部位为七叶鬼灯檠抑菌作用的主要活性部位。研究表明鬼灯檠属植物的根状茎中含有岩白菜素、7-甲氧基岩白菜素、鬼灯檠酯、麦角甾醇、紫丁香酸、没食子酸、熊果苷、谷甾醇、芳樟醇和槲皮素等化学物质［14-16］。其主要成分岩白菜素具有抗炎、抗溃疡、护肝、抗凝血、止咳等功效［17］。因此，我们推测岩白菜素为七叶鬼灯檠根状茎提取物的主要抑菌成分，但其抑菌活性还有待进一步的研究证实。

表2 七叶鬼灯檠根状茎不同提取物的抑菌圈直径(mm，n=3)Table 2 Diameter of inhibition zone of different extracts from R.aesculifolia(mm，n=3)

4 结论

七叶鬼灯檠根状茎的挥发油及提取物含有天然抑菌活性物质，具有光谱的抑菌效果，值得进一步开发利用。本研究为新型植物源抑菌药物的筛选、抑菌谱测定和提取过程的追踪提供了可供参考的数据资料，为深入研究七叶鬼灯檠的抑菌活性物质、进一步开发利用该资源提供了理论依据。

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