响应面分析法优化交沙霉素发酵培养基

胡 平，林开春

(1.恩施职业技术学院 生物工程系，湖北 恩施 445000； 2.华中农业大学 植物科学与技术学院，湖北 武汉 430070)

响应面分析法优化交沙霉素发酵培养基

胡 平1，2，林开春2*

(1.恩施职业技术学院 生物工程系，湖北 恩施 445000； 2.华中农业大学 植物科学与技术学院，湖北 武汉 430070)

以交沙霉素产生菌R29为供试菌株，采用响应面法综合实验设计，利用SAS分析软件对交沙霉素发酵培养基进行了优化.结果表明：棉籽饼粉和豆油为主效应因素，且培养基中棉籽饼粉和豆油最佳比例分别为1.9%和0.405%时，预测交沙霉素的发酵效价为220.6 μg/mL.经验证试验，最优条件下交沙霉素的发酵效价为221.8 μg/mL，与预测值相近，比原始配方下交沙霉素的发酵效价提高了10.66%.说明优化的发酵配方确实比初始配方更有利于菌株R29的产素.

响应面分析法；交沙霉素；发酵培养基

交沙霉素是那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)产生的一种十六元环大环内酯类抗生药物，于1964年由日本山之内制药株式会社研制而成，对葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、脑膜炎双球菌和百日咳杆菌、梭状芽胞杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌、布氏杆菌、军团菌、螺旋杆菌、支原体、立克次体、衣原体、螺旋体等亦有较好抗菌作用[1]，临床用于呼吸道感染、支气管炎、肺炎、副鼻窦炎、中外耳炎、皮肤感染、术后创口感染、泌尿科、五官科、口腔科感染等，疗效确切.自诞生以来，它就在世界范围内广泛应用于临床了[2-3].但是在国内的应用仅处于起步阶段，目前尚无厂家生产原药，具有相当大的研发潜能.为尽快实现交沙霉素原料药的国产化，首先要提高交沙霉素产生菌的产素能力，而优化发酵培养基是其中的关键环节之一.近年来，国内外很多研究人员利用响应面分析法(Response Surface Analysis，RSA)在培养基优化方面取得了良好的效果[4-6].笔者以本实验室的交沙霉素产生菌R29为供试菌株，采用响应面法综合实验设计，利用SAS分析软件对发酵培养基进行了优化，为该菌的产业化开发提供现实依据.

1 材料与方法

1.1 供试菌种

交沙霉素产生菌那波链霉菌交沙霉素变种(Streptomycesnarbonensisvar.Josamyceticus)R29菌株，由武汉天惠生物工程有限公司提供.

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基 土豆泥10%,麦片2.5%,精氨酸0.02%,琼脂2%,消前pH7.2～7.4.

1.2.2 种子培养基 葡萄糖1.0%,淀粉1.0%,黄豆饼粉1.5%,硫酸镁0.05%,酵母粉0.5%,碳酸钙0.3%,磷酸氢二钾0.5%.消前pH8.0.

1.2.3 发酵培养基 葡萄糖2.0%,棉籽饼粉2.0%,豆油1.0%,碳酸钙0.3%,玉米淀粉4.0%,磷酸二氢钾0.03%,面筋粉2.0%,硫酸镁0.05%,氯化钠0.1%,消前pH8.0.

1.3 菌种发酵

将保藏的斜面菌种用竹签打块接入种子培养基，28℃、180 r/min摇床培养34 h.将种子培养液接入发酵培养基，接种量8%，28℃、180 r/min摇床培养8 d.

1.4 交沙霉素检测

采用高效液相色谱法(HPLC)：色谱柱为C18反向柱(填料Hypersil ODS 25 μm，4.6 mm×250 mm)；柱温为室温；流动相为磷酸缓冲液(0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液，用1 mol/L的磷酸调节pH值为3)-甲醇(体积比为20∶80，pH 3)；流速为1.0 mL/min；紫外检测波长为232 nm；进样量为10 μL；交沙霉素参考品为杭州民生药业生产的交沙霉素糖衣片，含量200 mg/片.

表1 试验因素编码水平及结果

1.5 优化设计方法

1.5.1 Placket-burman (PB)设计 采用PB设计的两水平法对交沙霉素产生菌发酵培养基的9种成分进行试验，筛选交沙霉素发酵的主效应因素.

1.5.2 最陡爬坡试验 根据方法1.5.1中得出的一次拟和方程设计最陡爬坡试验.方程中变量的系数如果为正，则该水平应设计为递增，反之递减；变量系数的大小决定变化幅度，系数越大，变化的幅度越小，反之越大.

1.5.3 Box-wilson中心组合设计和响应面分析 以方法1.5.2中得到的中心点，根据Box-wilson中心组合设计原理设计响应面分析试验.根据响应面试验设计结果，运用SAS软件进行回归拟合，得到模型方程，根据所得模型的响应面分析立体图，结合回归方程，求得模型极值点，该点代表的主效应因子数据即为预测的最佳发酵培养基配方比例值.

1.5.4 验证性试验 分别在预测最优发酵条件和初始条件下进行发酵试验，重复5次，根据交沙霉素在预测最优发酵条件下的实际平均效价值，与初始条件下的结果进行比较，验证该模型的预见是否准确，从而确定交沙霉素的发酵培养基最佳配方.

2 结果与分析

2.1 PB设计试验结果

以R29为供试菌株进行PB设计的试验方案及结果见表1、表2.表1中棉籽饼粉和豆油的Pr>|t|分别为0.034和0.022，即表示这两个因素在95%的置信区间显著.

用SAS软件对试验数据进行回归分析，得到一次回归方程：

Y=427-32.0A+6.17B-7.00C-2.17D-40.2E+4.17F+4.83G-1.67H-2.50J.

经过回归数据分析，R-Sq=97.5%，R-Sq(adj)=86.1%，系数数值大，表明拟合良好，P=0.048，小于0.05，表明回归方程拟合良好.

根据表1中t-检验结果可知，棉籽饼粉和豆油为重要因素，在95%置信区间其可信度分别为96.6%和97.8%，可考虑作为主效应因子进行下一步的优化试验.

表2 Placket-burman试验设计结果

表3 最陡爬坡试验设计及试验结果

表4 中心组合设计试验变量及水平

表5 响应面试验设计及结果

图1 响应面立体分析图Fig.1 The graph of response surface analysis

2.2 最陡爬坡试验结果

根据PB试验结果可知棉籽饼粉和豆油为重要因素，而葡萄糖、碳酸钙、玉米淀粉、磷酸二氢钾、面筋粉、氯化钠和硫酸镁均对交沙霉素的产出无显著影响，这些因素保持原始水平不变.根据PB试验得出的一次拟和方程对棉籽饼粉和豆油进行最陡爬坡试验，结果如表3所示.可知最优条件在处理6和处理7之间，故采用1.9%棉籽饼粉，0.4%豆油为后续响应面试验的中心点.

2.3 中心组合设计及响应面试验设计结果

保持发酵培养基配方中除棉籽饼粉和豆油以外的其它6个因素水平不变，以中心点(棉籽饼粉1.9%，豆油0.4%)，对棉籽饼粉和豆油两个因素进行中心试验组合设计.中心点重复5次，保证拟合方程具有旋转性和通用性，中心组合试验设计见表4，响应面试验设计及结果见表5.

将相应面中得到的数据，利用SAS软件回归拟合，得到交沙霉素效价的二次经验模型为：Y=546.80+3.81A+7.21B-95.34A2-85.34E2+11.75AE；同时得到响应面分析立体图见图1，从图1可以看出，棉籽饼粉和豆油对交沙霉素产出的效应存在着一定的交互作用.对Y进行回归系数评估，结果表明A2和E2在大于F值的概率(Pr>F)分别为0.001、0.002，即A2和E2为显著影响项；变异系数的分析表明，2次项影响在大于F值的概率(Pr>F)为0.001，即2次项影响为显著影响项；方差分析数据表明在大于F值的概率(Pr>F)为0.005，说明回归方程有很高的可靠性和显著性；且拟合方程的决定系数R2值为0.959 9，表明该方程与实际有很好的拟合性，可用来进行交沙霉素发酵效果的分析和预测.根据回归方程结合响应面分析立体图，求得模型极值点为A=0，E=0.05，对应棉籽饼粉和豆油分别为1.9%和0.405%，此时预测交沙霉素的发酵效价为220.6 μg/mL.

2.4 验证性试验结果

选用菌株R29在预测最优条件即和发酵初始条件下进行发酵试验，得到实际平均交沙霉素发酵效价分别为221.8 μg/mL和200.4 μg/mL，最优条件下交沙霉素的发酵效价与预测值相近，说明该模型能准确的预见交沙霉素的实际发酵效价，同时优化得到的发酵培养基配方下交沙霉素的发酵效价比原始配方下交沙霉素的发酵效价提高了10.66%，说明优化的发酵配方确实比初始配方更有利于菌株R29的产素.

3 讨论

通常发酵培养基的优化方法是采用单因素试验，但单因素试验因无法考察到各因素之间的交互影响而存在一定的局限性，因而该方法不是总能获得最佳条件[7].此外，若考察的因素较多，则实验次数会较多，周期长，为了弥补单因素试验的缺陷，许多研究人员在单因素试验的基础上采用了正交设计法[8-9]、二次正交旋转组合设计[10]、均匀设计法[11，12]、改进单纯形法[13-14]和响应面分析[15]等方法进行条件的优化工作.本试验首次将PB设计、最陡爬坡试验、中心组合设计和响应面分析等方法运用于交沙霉素产生菌发酵培养基的优化试验中，并借助SAS统计软件快捷可靠地获得了较优的发酵培养基配方，取得了较好的效果.因此，采用相应面法优化发酵培养基是一种行之有效的实验方法，但此研究仅限于摇瓶发酵，仍需上罐分批发酵进一步验证，而且，本试验并未对装料量、通气、起始pH值、温度、转速、诱导物、前体物质和补料等其他的发酵工艺参数进行研究试验，对这些发酵条件尚需进一步探索.

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OptimizationofFermentationMediumforJosamycinUsingResponseSurfaceAnalysis

HU Ping1，2，LIN Kai-chun2*

(1.Department of Biological Engineering，Enshi Technical College，Enshi 445000，China； 2.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agriculture University，Wuhan 430070，China)

Experiments were designed to optimize the fermentation medium of josamycin R29 by the response surface analysis, using SAS analysis software to optimize.The results showed that the main effect factors were cottonseed cake powder and soybean oil,and the fermentation titer of josamycin was expected to be 220.6 μg/mL when the proportion of cottonseed cake powder and soybean oil was 1.9% and 0.405% respectively.And the validation test showed that,the josamycin fermentation titer was 221.8 μg/mL in the optimal conditions，similar to forecast,which was 10.66% higher than the initial medium components before optimization,showing that optimization of the fermentation medium does more than the original.

response surface analysis; josamycin; fermentation

2013-05-08.

武汉天惠生物工程有限公司自筹项目.

胡平(1981- )，女，讲师，硕士，主要从事生物制药技术的教学与研究；*

：林开春(1949- )，男，副教授，硕士，主要从事发酵工业方面的研究.

Q816；TQ92

A

1008-8423(2013)02-0138-04