低温沉淀法提取高纯度蛋黄卵磷脂的工艺研究

肖文婷，张 帆，李 燕，范杰平，朱建航，*

(1.南昌大学环境与化学工程学院低碳生物技术研究中心，江西南昌330031;2.南昌大学生命与食品科学学院，江西南昌330029)

卵磷脂(lecithin)是一种从植物或动物中提取出来的磷脂混合物，主要包括磷脂酰胆碱(phosphotidylcholine，简称 PC)、磷 脂酰乙醇胺(phosphotidylethanolamine，简称 PE)、磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol，简 称 PI)、磷 脂 酰 丝 氨 酸(phosphotidylserine，简称PS)等几种组分，具有重要的生理活性［1］，被广泛应用于食品加工、医疗保健、饲料加工、化妆品行业［2－4］。卵磷脂主要来源于大豆和蛋黄，蛋黄卵磷脂中磷脂酰胆碱含量高于大豆3倍，且氧化稳定性更好，所以近年来蛋黄卵磷脂的功能研究和应用开发日益受到人们的关注［5］。目前蛋黄卵磷脂的制备方法主要有溶剂提取法、金属离子沉淀法、超临界萃取法、柱层析法、膜分离法、酶催化法等［1］，且以溶剂提取法最具工业应用价值。1981年Larsen等［6］以单一溶剂提取蛋黄卵磷脂，提取率可达71.6%(换算成得率为7.20%)，但纯度仅为51.4%，限制了其进一步的应用。此后谢宪章等［7］采用二元混合溶剂提取蛋黄卵磷脂，提取率和纯度均优于单一溶剂，但该工艺毒性溶剂残留较大。为改善溶剂残留问题，Sim［8］以乙醇为溶剂，并结合低温冷藏去除甘油三酯，制得纯度为82%的卵磷脂，虽然该方法可有效控制有毒溶剂的残留，但产品胆固醇含量较高，磷脂组分的纯度偏低。为进一步提高产品纯度，Palacios［9］用4℃丙酮去除胆固醇和中性油脂，使纯度达90%以上，但该工艺操作步骤较多，溶剂用量大，提取率不高，实际生产过程中也受到一定的限制。因此，开发简单易行、高附加值的高纯蛋黄卵磷脂提取工艺已成为亟待解决的研究热点。本研究以鸭蛋蛋黄液为原料，利用低温沉淀法提取高纯度蛋黄卵磷脂，探讨了各因素对卵磷脂得率和纯度的影响，通过实验优化分析，得到了最佳提取工艺条件。与传统工艺相比，该工艺操作简便、提取率高、节约成本，可为蛋黄卵磷脂的工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鸭蛋 市购;磷脂酰胆碱(PC)标准品、磷脂酰乙醇胺(PE)标准品 Sigma公司;无水乙醇、正己烷、丙酮、钼酸铵、盐酸 分析纯，市购;甲醇、乙腈色谱纯，市购;分析用水 二次蒸馏水，自制。

BSA124S电子分析天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;85－2型恒温磁力搅拌器 郑州长城科工贸有限公司;RE－52旋转蒸发器 上海申生科技有限公司;MDF－U333超低温冰箱 SANYO Electric Biomedical Co.，Ltd.;UV762紫外可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司;DZF－6050型真空干燥箱 上海一恒科技有限公司;Agilent 1100高效液相色谱仪 美国Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 称取一定量鸭蛋蛋黄液，加入适量无水乙醇，在25℃恒温搅拌条件下提取30min后，过滤，滤渣重复以上步骤两次。收集上清液，减压蒸馏至近干，先加入适量正己烷使其完全溶解，再加入一定比例丙酮，然后放入超低温冰箱中冷冻12h取出，倾注分离出沉淀物，经低温丙酮洗涤数次，真空干燥，得高纯度蛋黄卵磷脂，称重，检测。

1.2.2 磷脂含量测定 采用定磷比色法［10］测定含磷量，使用系数25将含磷量换算为磷脂的含量［11］。计算公式为:

式中:P－标准曲线查得的含磷量(mg);n－稀释倍数;m－试样质量(g);25－每毫克磷相当于磷脂的毫克数。

1.2.3 HPLC检测 采用高效液相色谱法测定样品纯度［12－15］。采用外标法定量，计算样品中 PC、PE 组分含量。色谱条件为色谱柱:Sinochrom Si 60柱(4.6mm ×250mm，5μm);流动相:乙腈－甲醇－85%磷酸(7∶2∶0.09，v/v);流速:1.0mL/min;柱温:30℃;紫外检测波长:210nm;进样量:10μL。

1.2.4 实验设计 蛋黄卵磷脂的提取受到诸多因素的影响，本文以卵磷脂得率和磷脂含量为衡量指标，研究料液比、己烷－丙酮体积比、冷冻温度等因素对卵磷脂提取效果的影响。在单因素实验中，料液比(g/mL)设定为 1∶3、1∶3.5、1∶4、1∶4.5、1∶5;己烷－丙酮体积比为 1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5;冷冻温度为－40、－30、－20、－10、0℃，通过单因素实验对提取工艺初步优化。为获得最佳提取工艺条件，在单因素实验的基础上进行三因素三水平正交实验L9(34)(见表1)，分析结果确定提取高纯度蛋黄卵磷脂的最佳工艺条件。考虑到实际生产，确定评价指标中权重关系为综合指标Z=0.6×磷脂含量+0.4×得率［16］，即 Z=0.6X+0.4Y。

表1 正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对蛋黄磷脂提取效果的影响 在己烷－丙酮体积比1∶2.5，冷冻温度－20℃条件下，考察了提取过程中料液比对卵磷脂得率和含量的影响，结果见图1。随着料液比的增大，卵磷脂得率和磷脂含量均有明显上升。这是因为增大溶剂用量即增大了蛋黄液与乙醇溶剂的接触面积，促进了蛋黄中磷脂的溶解。当料液比达1∶4(g/mL)后得率和磷脂含量上升趋势逐渐减小，且磷脂含量于1∶4.5(g/mL)处达到最大值。综合考虑，实验选择的料液比为1∶4.5(g/mL)。

图1 料液比对提取效果的影响Fig.1 Influence of egg yolk－ethanol ratio on extraction effect

2.1.2 己烷－丙酮体积比对蛋黄磷脂提取效果的影响 在料液比1∶4.5(g/mL)，冷冻温度－20℃条件下，考察了己烷－丙酮体积比对卵磷脂得率和含量的影响，结果见图2。随着己烷－丙酮体积比减小，卵磷脂得率是先增后减，于1∶2.5时达到最大值;而磷脂含量逐渐增加，增加幅度越来越小。这可能是因为随着体积比减小，己烷－丙酮体系体积变大，卵磷脂及中性脂质部分溶解，且中性脂质溶解量比卵磷脂更大，导致卵磷脂得率下降，含量上升。考虑到实际生产中的溶剂成本，实验选择己烷－丙酮体积比为1∶2.5。

图2 己烷－丙酮体积比对提取效果的影响Fig.2 Influence of hexane－acetone volume ratio on extraction effect

2.1.3 冷冻温度对蛋黄磷脂提取效果的影响 在料液比1∶4.5(g/mL)，己烷－丙酮体积比1∶2.5的条件下，考察了冷冻温度对卵磷脂得率和含量的影响，结果见图3。随着冷冻温度升高，卵磷脂得率逐渐降低，且降低幅度逐渐增大;而磷脂含量先升高后降低，在－20℃时达到最大值。这可能是在低温条件下中性脂质和磷脂在己烷－丙酮溶剂体系中的溶解性相互作用和影响造成的［17］。在温度低于－20℃时，其他油脂类物质的溶解度随温度变化更显著，导致温度升高时，得率略有降低，含量有所提高;在温度高于－20℃时，卵磷脂的溶解度随温度变化更显著，导致温度升高时，卵磷脂在溶剂中溶解度增大，从而得率和含量都急剧下降。综合考虑，实验选择冷冻温度为－20℃。

图3 冷冻温度对提取效果的影响Fig.3 Influence of frozen temperature on extraction effect

2.2 正交实验

在单因素实验基础上进行正交实验优化提取工艺条件。综合考察料液比、己烷－丙酮体积比、冷冻温度三个因素的影响，按照L9(34)正交表进行实验，正交实验设计和结果见表2。

表2 正交实验结果Table 2 Results of orthogonal design

由表2可知，影响卵磷脂得率和含量的因素主次顺序为:C(冷冻温度)＞A(料液比)＞B(己烷－丙酮体积比)。通过极差分析得到最佳工艺条件:A2B3C2，即料液比 1∶4.5，己烷－丙酮体积比 1∶3，冷冻温度－20℃。从极差值可以看出，己烷－丙酮体积比对实验结果影响较小，综合考虑实际生产成本，验证实验选择的条件为:料液比1∶4.5，己烷－丙酮体积比1∶2.5，冷冻温度－20℃，进行3组重复实验后，测得产品得率为9.37%，磷脂含量为97.68%。

2.3 HPLC检测结果

利用高效液相对标准品及样品进行检测，结果见图4。

图4 高效液相色谱图Fig.4 The HPLC Chromatogram

由图4可以看出，在8.6和9.2min左右，PC标准品和样品均出现两个峰，这是因为PC本身是混合物，其R2位置上存在多种基团，如油酸、亚油酸、花生四烯酸等，导致PC中存在多种单质，如1－棕榈酸－2－二花生四烯酸磷脂酰胆碱、1，2－花生四烯酸磷脂酰胆碱、1，2－二亚油基磷脂酰胆碱等［18－19］。由于这些单质在结构上存在微小差别，造成出峰时间有一定差异，从而出现上图中的峰形。

样品中主要组分的峰形和PC、PE标准品基本一致，表明样品主要组分为PC和PE，通过外标法定量测得PC含量为77.42%，PE含量为18.47%。

3 结论

研究了料液比、己烷－丙酮体积比、冷冻温度对蛋黄卵磷脂提取效果的影响，并通过正交实验优化提取工艺，得到最佳工艺条件:料液比1∶4.5(g/mL)，己烷－丙酮体积比1∶2.5，冷冻温度－20℃，该条件下产品的得率可达9.37%，磷脂含量为97.68%。采用高效液相色谱法对样品进行检测，结果表明样品中PC和PE组分含量分别为77.42%和18.47%。本工艺具有操作简单、提取效果好、成本低等优点，对工业化生产鸭蛋黄卵磷脂有着重要的参考价值和指导意义。

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