葡萄酒泥酵母超氧化物歧化酶分离提取工艺条件优化

杜 娜，杨学山，韩舜愈，祝 霞，付文力，王 婧，盛文军，张 波

(1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070;2.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070)

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD，EC1，15，1，1)是广泛存在于生物体内的一种胞内金属酶，可催化超氧阴离子(superoxideanions，O2－·)与H+发生歧化反应，解除O2－·对机体的毒害［1］。因此，SOD制剂已被广泛应用于医疗、食品及化妆品领域［2］。自1969年 Mccord从牛血中发现SOD以来，人们已从猪、牛、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物和微生物中分离化出SOD，其中利用微生物生产SOD具有成本低、周期短、适用于规模化生产和所得产品安全性高等特点［3－6］。研究证实，真核微生物的SOD含量一般高于原核微生物，其中酵母菌含有丰富的线粒体，呼吸系统最完整，因而SOD含量高于其它丝状真菌，可以作为 SOD的主要生产菌种［7－8］。葡萄酒泥是葡萄酒酿造过程中的主要副产物，含有大量的酵母细胞［9］。据统计，2011年我国葡萄酒年产量已达123.2万t，加工各个阶段产生酒泥量约占总加工量的4%～5%［10］。但目前国内葡萄酒泥酵母尚未得到充分利用，大多数企业将其作为饲料、肥料，附加值很低，有一些甚至作为垃圾倾倒，不仅污染环境，而且浪费了宝贵的生物资源［11］。因此，利用葡萄酒泥酵母生产SOD，有较大的经济意义和社会意义。酵母具有较为坚固的细胞壁，破壁效果直接影响SOD的分离提取。苏昕等［12］研究了发酵培养Y12酵母菌分离制备酵母SOD，并对其部分酶学性质进行了深入的探讨;廖湘萍等［13］采用异丙醇破壁法对啤酒酒泥酵母生产SOD进行了研究;王岁楼等［14］采用甲苯破壁法从活性干酵母中直接提取SOD，但利用葡萄酒泥酵母纯化SOD尚未见报道。甲苯可溶解酵母细胞膜磷脂层，改变细胞膜结构，提高细胞膜的通透性，从而使胞内物质释放使［15］。因此，本实验以葡萄酒泥酵母为原料，采用效果较好的甲苯法对酵母细胞进行破壁，并通过正交实验优化提取工艺参数，以期建立较为高效的技术路线，为葡萄酒泥酵母的资源化利用提供一定的技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄酒酵母泥 甘肃祁连葡萄酒业有限公司;牛血清白蛋白 pharmacia公司;SOD活性测定试剂盒 南京建成生物工程有限公司;甲苯、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、EDTA、柠檬酸、Na2HPO4－12H2O、考马斯亮蓝等常规试剂均为国产分析纯。

SL－1001电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;TDZ5－WS离心机 湖南仪离心机仪器有限公司;HH－6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;PHS－3C pH计 上海雷磁有限公司;808型紫外－可见分光光度计 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄酒泥酵母SOD提取技术路线 葡萄酒泥→预处理→收集湿酵母→加入甲苯→热处理→加入磷酸盐缓冲液→室温浸提→离心→热变性→离心→提取液→SOD活性及蛋白质含量测定。

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 葡萄酒泥酵母预处理 将葡萄酒酒泥与蒸馏水以1∶1混合，用80目筛筛分，4000r/min离心20min。重复上述步骤，直至所得沉淀为白色，上清液无色透明为止，收集沉淀备用。

1.2.2.2 甲苯破壁 1g湿酵母中加入0.8mL的甲苯溶液，35℃保温 45min后，加入 pH7.8、0.05mol/L的磷酸缓冲液(含0.1mmol/L EDTA)3mL，室温浸提5h，4000r/min离心15min，收集上清液。

1.2.2.3 热变性 收集的上清液置于55℃水浴锅中热处理15min，4000r/min离心15min，除去杂蛋白，即得SOD酶液。取样进行SOD活性及蛋白质含量测定。

1.2.3 单因素实验设计

1.2.3.1 甲苯用量对SOD提取的影响 称取5份各2g 湿酵母细胞，分别加入0.8、1.6、2.4、3.2、4mL 甲苯，35℃保温处理45min，加入0.05mol/L、pH7.8磷酸盐缓冲液6mL，搅拌均匀后在室温条件下浸提5h，离心、热变性去除杂蛋白。测定SOD活性及蛋白质含量。

1.2.3.2 甲苯作用时间对SOD提取的影响 称取5份各2g湿酵母细胞，加入0.8mL甲苯，35℃条件下分别处理 15、25、35、45、55min，加入 0.05mol/L、pH7.8磷酸盐缓冲液6mL，搅拌均匀后在室温条件下浸提5h，离心、热变性去除杂蛋白。测定酶活性及蛋白质含量。

1.2.3.3 甲苯作用温度对SOD提取的影响 称取5份各2g湿酵母细胞，加入0.8mL的甲苯，分别在30、35、40、45、50℃ 保温处理 35min 后，加入 pH7.8、0.05mol/L磷酸盐缓冲液6mL，搅拌均匀在室温条件下浸提5h，离心、热变性去除杂蛋白。测定酶活性及蛋白质含量。

1.2.3.4 磷酸缓冲液pH对SOD提取的影响 称取5份各2g湿酵母细胞，分别加入甲苯0.8mL，45℃保温处理 35min，依次加入 pH7.2、7.4、7.6、7.8、8.0 的0.05mol/L磷酸盐缓冲液6mL，搅拌均匀后在室温条件下浸提5h，离心、热变性去除杂蛋白。测定SOD活性及蛋白质含量。

1.2.4 正交实

验优化 根据单因素实验结果确定葡萄酒泥酵母中提取SOD的正交实验因素和水平，采用L9(34)正交实验设计，优化SOD提取工艺，平行重复3次。

表1 L9(34)正交实验因素水平表Table 1 Factors and their levels in L9(34)orthogonal array design

1.2.5 蛋白质含量测定 本实验采用马斯亮蓝法测定蛋白质含量［16］。通过实验数据绘制的蛋白质标准曲线线性回归方程为:y=0.0049x－0.0069(R2=0.9989)。符合测定要求。

1.2.6 SOD酶活力测定 采用SOD活性测定试剂盒进行。根据蛋白质含量和酶活力测定值计算比活力。

2 结果与分析

2.1 单因素结果与分析

2.1.1 甲苯用量对SOD提取的影响 由图1可知，甲苯用量不同时，所提取的SOD酶比活力不同。当甲苯用量为0.8mL/g时，SOD的比活力最高，提取效果最好，所以选择0.8mL/g为SOD提取的较佳甲苯用量。这主要是由于当甲苯用量不足时，酵母细胞壁没有得到充分破碎，导致SOD释放不完全;过量的甲苯会影响SOD活性，导致酶比活力下降。

图1 甲苯用量对SOD比活力的影响Fig.1 Effect of different amount of toluene on the activity of SOD

2.1.2 甲苯作用时间对SOD提取的影响 由图2可知，甲苯作用时间不同，提取的SOD比活力不同。其中，甲苯作用时间为35min时所提取的SOD酶比活力最高，所以应选择35min为较佳甲苯作用时间。当甲苯用量一定时，较短的作用时间，使酵母细胞壁破碎不充分，提取物中SOD含量较低，导致比活力较低;而较长的作用时间，虽然酵母细胞壁破碎较为充分，但也会导致酵母细胞中其他蛋白组分溶出，影响酶比活力。

图2 甲苯作用时间对SOD比活力的影响Fig.2 Effect of different wall－broken time on the activity of SOD

2.1.3 甲苯作用温度对SOD提取的影响 由图3可知，当加入一定量的甲苯后，作用温度不同时，所提取的SOD酶比活力存在差异。其中，当作用温度为45℃时，所提取的 SOD酶比活力最高，所以选择45℃为甲苯作用的最佳温度。这是由于温度过低时，不利于甲苯对酵母细胞壁的破碎，使SOD不能充分释放;温度过高，影响SOD稳定性，导致比活力下降。

图3 甲苯作用温度对SOD比活力的影响Fig.3 Effect of different temperature on the activity of SOD

2.1.4 磷酸缓冲液pH对SOD提取的影响 由图4可知，当磷酸缓冲液pH为7.8时，SOD的比活力最高，提取效果最好，所以选择pH7.8为SOD提取的较佳磷酸缓冲液pH。当磷酸缓冲液pH小于或大于7.8时，都会使所得到的SOD比活力下降，造成这一结果的原因可能是不同pH条件下SOD的活性存在差异，进而影响所得SOD酶比活力。

图4 磷酸缓冲液pH对SOD比活力的影响Fig.4 Effect of different pH of phosphate buffer on the activity of SOD

2.2 正交实验结果与分析

根据单因素实验结果，以SOD比活力为考察指标，进行了L9(34)正交实验，实验结果见表2。通过直观分析和方差分析得到最优组合，进行验证实验，确定甲苯法提取SOD的最优工艺。

由表2的数据结果可得出影响甲苯法提取葡萄酒酒泥酵母SOD因素的主次顺序为:A＞C＞B＞D。甲苯法提取葡萄酒酒泥酵母SOD正交实验的最优组合是 A2B1C3D3，即甲苯用量 0.8mL/g，作用时间25min，作用温度50℃，磷酸缓冲液pH8.0。

表2 L9(34)正交实验设计及结果表Table 2 L9(34)orthogonal array design arrangement and experimental results

用spss17.0统计软件对实验结果进行方差分析，其结果见表3。

表3 正交实验方差分析结果Table 3 Analysis of variances for extraction yield of polysaccharides with various extraction conditions

由表3可知，甲苯用量、作用时间、作用温度对SOD比活力影响显著(p＜0.05)，对实验结果影响较大。

2.3 验证实验结果

因正交实验得到的最优组合在L9(34)中未出现，需对最优组合进行验证实验。在甲苯用量0.8mL/g，作用时间25min，作用温度50℃，磷酸缓冲液pH8.0的条件下提取SOD。重复3次，SOD平均酶比活力为178.73U/mg，比正交实验中最优组合得到的酶比活力高。

3 结论

本实验以葡萄酒酒泥酵母为原料，通过L9(34)正交实验确定的最优工艺参数为甲苯用量0.8mL/g，作用时间25min，作用温度50℃，磷酸缓冲液pH8.0，在此条件下提取 SOD，所得 SOD平均比活力为178.73U/mg。

甲苯虽然具有一定毒性，但可通过后续的离子交换层析等工艺去除。因此，利用甲苯破壁法分离纯化葡萄酒泥酵母SOD简单易行，较为廉价，可为葡萄酒泥酵母开发生产SOD提供技术支持。

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