肾宁合剂微生物限度检查方法的验证

曾云胜 张先洲

1.湖北省仙桃市第一人民医院药剂科，湖北仙桃 433000；2.武汉大学人民医院药学部，湖北武汉 430060

肾宁合剂是本院结合临床研制的医院制剂，由黄芪、益母草、败酱草、川芎等组成，具有益气活血、利水消肿、调节免疫功能的功效，用于急慢性肾炎、肾病综合征、糖尿病性肾病、急慢性肾功能衰竭等疾病。据调查目前微生物限度不合格是医院制剂不合格的主要因素之一[1]，为控制产品质量，本研究按照2010年版《中华人民共和国药典》（简称“中国药典”）附录的相关规定[2]，参考相关文献对肾宁合剂微生物限度检查方法进行了验证[3-4]，以保证患者用药的安全有效，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 供试品

肾宁合剂，规格：100 ml，由本院制剂室生产；批号:20120413。1.2培养基

营养琼脂培养基，批号：110116；营养肉汤培养基，批号：110112；玫瑰红钠琼脂培养基，批号：110112；4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG），批号：100820；pH 7.0改良马丁琼脂培养基，批号：101106；无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：100824。以上培养基均由北京三药科技开发公司提供。

1.3 验证试验用菌种

金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，枯草芽胞杆菌 （Bacillus subtilis）[CMCC （B）63501]， 黑曲霉（Aspergil1us niger）[CMCC（F）98003]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]。 以上菌种均由中国药品生物制品检定研究院提供。

1.4 仪器和设备

SHINVA立式压力蒸汽灭菌器 （山东新华医疗器械股份有限公司），超净工作台（蚌埠净化设备厂），LRH-250生化培养箱 （上海一恒科学仪器有限公司），HTY-2000A集菌仪，HTY反复使用集菌培养器 （杭州高得医疗器械有限公司）等。

2 细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证

2.1 菌液制备

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，经25℃培养18～24 h，取1 ml加入到9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5，为50～100 CFU/ml菌悬液备用。

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽胞杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基上，经35℃培养18～24 h，取1 ml加入到9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-6～10-7（50～100 CFU/ml）的菌悬液备用。

接种黑曲霉菌的新鲜培养物于改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养5 d，加入0.05% 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液5 ml，将孢子洗脱，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液10倍递增稀释制成每毫升含孢子数50～100 CFU的孢子悬液，备用。

将上述5种菌液分别接种至相应的培养基上，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌，35℃培养2 d；黑曲霉、白色念珠菌，25℃培养 2～3 d。

2.2 供试液制备

取供试品10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1︰10的供试液。

2.3 细菌、真菌及酵母菌计数方法的验证

供试品对照组：取1∶10的供试液1 ml，立即倾注琼脂培养基，凝固后，置规定温度下，细菌培养 24～48 h，白念珠菌和黑曲霉菌培养48～72 h，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。试验组：取1∶10的供试液1 ml和50～100 CFU/ml试验菌，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基及玫瑰红钠琼脂培养基，5种试验菌株每株试验菌分别制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。菌液组：取各试验菌50～100 CFU注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行制备2个平皿，凝固后，置规定温度下，细菌培养24～48 h，白色念珠菌和黑曲霉菌培养48～72 h，测定所加入的实验菌数。

试验组回收率计算：回收率=（试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%。

验证结果提示，5株试验菌人工染菌回收率达到70%以上，表明采用常规法做验证试验，方法可行（表1）。

表1 肾宁合剂微生物限度检查方法的验证结果（常规法）（CUF/ml）

3 控制菌检查方法的验证（常规法）

试验组：取1∶10的供试液10 ml和小于100 CFU/ml大肠埃希菌试验菌液加到100 ml胆盐乳糖増菌培养基中，35℃培养24～48 h。取培养物0.2 ml，接种至含MUG培养基5 ml的试管中，35℃培养24 h，在366 nm紫外灯下观察荧光，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。试验管MUG为阳性，靛基质试验为阳性，本底对照管为阴性。

阴性菌对照组：同试验组，取小于100 CFU的金黄色葡萄球菌加入到100 ml胆盐乳糖増菌培养基中。阴性菌对照组MUG为阴性，靛基质试验为阴性，本底对照管为阴性。

上述验证结果提示试验组检出了大肠埃希菌，而阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌，说明可采用常规法对本品进行控制菌（大肠埃希菌）检查。

根据以上验证结果，肾宁合剂的微生物限度检查按照中国药典2010年版第一部附录微生物限度检查法 （附录ⅧC）检查，细菌、真菌及酵母菌数测定和控制菌检查均可采用常规法检验。具体方法如下：

供试液制备：取本品供试液10 ml，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 ml，制成1∶10的供试液。

细菌数测定：取 1∶10、1∶100、1∶1000 的供试液，采用平皿法测定，符合规定。

真菌及酵母菌数测定： 取 1∶10、1∶100、1∶1000 的供试液，采用平皿法测定，符合规定。

大肠埃希菌的检查：取1∶10的供试液10 ml，加入到胆盐乳糖增菌培养基100 mL中，依法检查，符合规定。

4 讨论

肾宁合剂是由多种中药材经水煎煮醇沉提取后制成的澄明液体，含有多糖、淀粉、蛋白质类物质，这些物质为微生物繁殖提供了营养条件。如果微生物度检查呈假阴性，当样品存放后使用，会产生大量微生物甚至致病菌，因此对肾宁合剂进行微生物限度检查具有重要意义[5]。

本试验中菌液经稀释至适宜浓度后，若在室温下放置，应在2 h内使用，若保存在2～8℃可在24 h内使用，以确保细菌活性及菌数稳定[6-7]。本试验经过考查证明，以1∶10肾宁合剂样品作为最低稀释级供试液，能够消除药品在微生物限度检查中的抑菌作用，5种试验菌的回收率均大于70%，表明稀释剂 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无抑菌作用[8]，对实验无干扰，符合中国药典要求。

[1]安富荣，张纯.2004~2007年上海市医院制剂中抽检不合格制剂质量问题分析[J].中国药房，2008，19（28）：2211-2212.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2010：附录79-83.

[3]马绪荣，苏德模.药品微生物学检验技术[M].北京：华龄出版社，2007：209.

[4]兰鸿，李元宏，杨务彬.乳核内消液微生物限度检查方法学验证[J].医药导报，2011，30（6）：804-805.

[5]马亮英，蒋磊.小儿腹泻散微生物限度检查方法验证[J].中国现代药物应用，2011，20 （5）：123-124.

[6]卜生高，王劲争.喉咽清口服液微生物限度检查方法的验证[J].中国药事，2009，23（12），1210-12112.

[7]袁汀.清热合剂的微生物限度检查方法的验证[J].山西医药杂志，2011，40（9）：869-870.

[8]黄文娴，金国良，王元培.5种医院制剂微生物限度及其质量考察[J].抗感染药学，2011，8（3）：198-199.