3,4苯并芘对内皮祖细胞生物学功能的影响

贾国力 冉华中 季亢挺 王海珠 魏振衡 郁华 王魁风 邢程

内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）是一类能分化为成熟内皮细胞的前体细胞，在微血管新生、损伤血管内皮修复和功能维持中具有重要的作用[1-2]，其数量及功能的改变影响心血管病的进程。3,4-苯并芘（benzo(a)pyrene，BaP）,一种烟草和煤焦油燃烧的副产物，是香烟烟雾的重要组成部分[3]。研究表明，BaP能对多种细胞造成损伤，然其对EPC的影响未见报道。本研究观察BaP体外诱导对EPC生物学功能的影响，探讨吸烟与心血管疾病发生发展的关系，为寻求抑制方案提供依据。

材料与方法

一、材料

BaP和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司；计数试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）购自日本同仁化学研究所；Transwell小室为美国Corning公司产品。基质凝胶（Matrigel）为美国Becton Dickson公司产品；超氧化物歧化酶(orgotein superoxide dismutase,SOD)测试购自南京建成生物工程研究所。EGM-2培养基为瑞士Lonza公司产品。0.05﹪的胰酶为美国Invitrogen公司产品。人纤维连接蛋白(humanfibronectin,hFN)为Chemicon公司产品。人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、M199培养基和PBS液购自美国Gibco公司。其余为市售试剂（级别：L.R.）。

二、方法

1.EPC的培养[4]及鉴定：人脐带血采自温州医学院附属第二医院产科病房的健康产妇（足月、顺产），经产妇及其家属知情同意，每次采血量约50ml。采用密度梯度离心法分离获取脐血中的单个核细胞沉淀，以含10﹪FBS的EGM-2培养基重悬细胞，制成5×106个/ml密度的单个细胞悬液，接种于预先包被好hFN的6孔板中，置于37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中培养。24 h后，吸弃培养基，并用预温的D-Hank液轻轻冲洗2遍，然后添加含10﹪FBS的EGM-2培养基继续培养，以后每3 d换半液，待原代细胞长至90﹪汇合度时，便可进行传代。第2代细胞贴壁生长至70﹪～90﹪汇合度时，用0.05﹪胰酶消化收集，制成1×106个/ml的单个细胞悬液，将终浓度为2.4 μg/ml的DiI-ac-LDL加入6孔板有盖玻片的孔中，置于37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中避光孵育1～2h。吸掉培养液，4﹪多聚甲醛固定15min。PBS冲洗2次，每次3min，加入FITCUEA -I lectin(10mg/L)，继续避光孵育1h，取出盖玻片，用PBS轻轻洗掉浮色，加入抗淬灭剂，荧光显微镜下观察、拍片。

2.实验分组：第3代EPC生长至70﹪～90﹪汇合度时，吸弃培养基，以低FBS（含2﹪FBS）的EGM-2培养基继续培养24 h，使细胞同步化；然后以0.05﹪含EDTA的胰酶消化。收集细胞，并以含10﹪FBS的EGM-2培养基重悬细胞，制成5×106ml/L密度的单个细胞悬液。随机分为 5组 ：(1)正常对照组（Control）：不做任何处理；(2)溶剂对照组（DMSO，BaP的溶剂）：加入DMSO 浓度为 ：1ml/L ；(3)BaP各组（BaP①、BaP②、BaP③）：BaP浓度分别为 ：10、20、50 μmol/L。细胞置于37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中继续培养约24 h，待贴壁细胞生长至90﹪汇合度时，进行各项细胞功能检测。

3.增殖能力检测：待贴壁细胞生长至90﹪汇合度时，以0.05﹪含EDTA的胰酶消化收集各组贴壁细胞，并以低FBS（含2﹪FBS）的EGM-2培养基重悬各组EPC，制成单个细胞悬液，各组均以每孔5000个细胞的密度接种至预先包被有hFN的96孔板中，每组设6个复孔，另设调零孔，同样设6个复孔，每孔只添加含2﹪FBS的EGM-2培养液。然后将96孔板置于37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中培养。24 h后，吸弃培养基，重新添加含10﹪CCK-8溶液的培养基，培养4 h后，置酶标仪450 nm处测吸光度(A)值。

4.附能力检测：各组细胞均按5000个/孔的细胞密度接种至预先包被hFN的96孔板中，每组设10个复孔；置37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中培养30min，洗去未贴壁细胞，随机选取10个视野（×200），倒置显微镜下计数黏附细胞数。

5.迁移能力检测：上述各组细胞制成5×105个 /ml的单细胞悬液，于24孔板中放入transwell小室 ( 孔径 8 μm)，下室加入 600μl含10﹪FBS的EGM-2培养基，上室加入100μl上述细胞悬液；置于37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中孵育24 h；取出transwell小室，D-Hank液淋洗2次，用棉签擦去微孔膜上层的细胞，4﹪多聚甲醛固定10min；以0.25﹪结晶紫（crystal violet）染色，置于倒置显微镜下观察、拍片，各组均随机选取10个视野(×400)，计数迁移至下层的细胞个数，以评价各组EPC的迁移能力。

6.成血管能力检测：（1）Matrigel凝胶的配制：将Matrigel胶置于4℃溶解，将移液器，吸管，枪头，96孔培养板等置于4℃预冷；取50μl/孔加入96孔板中（冰上操作），37 ℃孵育1h成胶。（2）EPC成血管能力检测：各组细胞1×105个/ml的单个细胞悬液，按10000个/孔的细胞密度接种于铺被有Matrigel凝胶的96孔板中，每组设3个复孔，置于37℃、5﹪CO2饱和湿度培养箱中培养约24 h。取出96孔板，置于倒置显微镜下观察、拍片，各组均随机选取5个视野（×100）计数小管形成数量。

7.细胞培养上清液中SOD的活力检测：如上述EPC做分组处理后，收集各组细胞培养上清液，以SOD测试盒检测细胞培养上清液中SOD活力。操作依据说明书进行，然后置于可见光分光光度仪测各组吸光度，最后按说明书中换算公式得出统计数据。

三、统计学分析方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，EPC的增殖能力、黏附能力、迁移能力、成血管能力以及SOD活力的测定值等计量资料均以表示，单因素方差分析比较各组均数，组间比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、EPC的表型及鉴定

显微镜下细胞形态学特征：人脐血分离获得的单个核细胞在培养第4天开始出现细胞集落，长程培养形成典型的铺路石样结构（图1a）。Dilac-LDL摄取和FITC-UEA-1 lectin结合双荧光染色试验阳性，吞噬DiI-ac-LDL的培养细胞发红色荧光，结合FITC-UEA-1 lectin的培养细胞发绿色荧光。复合图像中，lectin荧光主要在胞膜，ac-LDL荧光主要在胞质（图1b）。

图1 光学显微镜下观察EPC形态

二、BaP对EPC迁移能力的影响

EPC分组处理24 h后，采用transwell小室检测各组EPC迁移能力的改变，结果显示：与正常对照组[(46.10±4.51)个/400倍镜]相比，BaP处理各组EPC的迁移能力均显著降低[BaP①组 (35.50±4.95)个 /400倍镜，BaP②组(26.80±4.08)个/400倍镜，BaP③组(19.50±2.84)个 /400倍镜，均 P < 0.01]，随着BaP作用浓度的增高，EPC的迁移能力呈浓度依赖性降低（均P < 0.01）；而正常对照组与溶剂对照组[(44.30±6.62)个/400倍镜]之间差异无显著性（P > 0.05）（图 2，表 1）。

三、BaP对EPC成血管能力的影响

各组处理因素作用24 h后，采用Matrigel凝胶体外成血管试验观察各组EPC体外成血管能力的变化情况，结果显示：与正常对照 组[(33.20±3.70)个/100倍 镜]相 比，BaP呈浓度依赖性降低EPC的成血管能力{[BaP①组 (22.00±3.39)个 /100倍 镜，BaP②组 (16.20±2.59)个 /100倍 镜，BaP③组(10.80±2.39)个 /100倍镜，均 P < 0.01]，BaP染毒组间成血管能力差异亦有统计学意义(两两比较，均 P < 0.05)}（图 3，表 1）。

四、BaP对EPC增殖能力的影响

处理因素作用24 h后，采用CCK-8细胞计数试剂盒检测各组EPC的增殖能力改变，结果显示：与正常对照组[(A)值为(1.02±0.04)]相比，BaP各组EPC的增殖能力均显著降低 [BaP ① 组 (A) 值 为 (0.66±0.04)，BaP②组 OD(0.55±0.04)，BaP ③ 组 (A) 值 为(0.35±0.05)，均 P < 0.01]，随着 BaP 浓度的加大，EPC的增殖能力也逐渐降低，呈明显浓度依赖性（均 P < 0.01，表 1）。

五、BaP对EPC黏附能力的影响

EPC分组处理24 h后，显微镜下贴壁细胞计数观察各组细胞的黏附能力改变，结果显示：与正常对照组[(117.50±17.16)个/200倍镜]相比，BaP呈浓度依赖性降低EPC的黏附能 力 [BaP①组 (80.00±14.46)个 /200倍 镜，BaP②组(66.00±9.06)个/200倍镜，BaP③组(49.80±10.72)个 /200倍 镜，均 P < 0.01，BaP染毒组间黏附能力差异亦有统计学意义(两两比较，均P < 0.05)]。正常对照组与溶剂对照组[(117.20±20.64)个/200倍镜]之间差异无统计学意义（P > 0.05，表 1）。

表1 BaP对EPC增殖、黏附、迁移及成血管能力的影响（）

表1 BaP对EPC增殖、黏附、迁移及成血管能力的影响（）

注：BaP为3,4-苯并芘，BaP①组浓度为10 μmol/L，BaP②组浓度为20 μmol/L，BaP③组浓度为50 μmol/L，与正常对照组比较，aP<0.01；BaP染毒组间比较，bP<0.05

分组 增殖能力（n=6）（OD值）黏附能力（n=10）（细胞个数）迁移能力(n=10)（细胞个数）成血管能力（n=5）（小管数）正常对照组 1.02±0.04 117.50±17.16 46.10±4.51 33.20±3.70溶剂对照组 1.01±0.03 117.20±20.64 44.30±6.62 31.80±3.96 BaP染毒组BaP①组 0.66±0.04ab 80.00±14.46ab 35.50±4.95ab 22.00±3.39ab BaP②组 0.55±0.04ab 66.00±9.06ab 26.80±4.08ab 16.20±2.59ab BaP③组 0.35±0.05ab 49.80±10.72ab 19.50±2.84ab 10.80±2.39ab F 值 314.158 41.188 56.875 62.707 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

图2 BaP呈浓度依赖性降低EPC迁移能力（个/400倍镜）

六、细胞培养上清液SOD活力的变化

处理因素作用24 h后，取上清液，采用SOD测试盒检测细培养上清液中SOD的活力水平，结果显示：与正常对照组[(22.6±2.19)U/ml]相比，BaP能明显降低细胞培养上清液中SOD的活力水平 [BaP ①组 (15.94±1.68)U/ml，BaP ②组(12.5±1.58)U/ml，BaP ③组 (6.9±1.55)U/ml，均P < 0.01]，随着BaP浓度的加大，上清液中SOD的活力水平显著降低，呈明显浓度依赖性。（均P < 0.01）。

讨 论

BaP是一种典型的多环芳烃类化合物，是香烟烟雾和汽车尾气的重要成分，其对人体健康的危害一直是生命科学领域研究的热点[5]。BaP进入细胞后，其代谢产物可阻断细胞生长分化调节的信号转导，引起细胞形态的改变，溶酶体受损，细胞膜破坏，DNA损伤等，从而导致不同组织和器官的损害，影响人体的健康。近年来研究发现，BaP可引起血管壁的病理学改变[6]，BaP和它的代谢产物具有促炎症作用，可导致组织和细胞中诸如巨噬细胞侵润、MMP表达的上升、核转录因子（NF-Kappa B）的激活[7-8]等生物学反应，引起血管内皮的损伤。

内皮损伤是动脉粥样硬化进程的开始，血管内皮损伤后内皮修复极为重要，内皮损伤后的修复过程除了原先存在的邻近成熟内皮细胞的出芽或迁移外，也可以通过EPC分化为成熟内皮细胞参与修复损伤的内皮。EPC又名成血管细胞，是指出生后机体中存在的能特异性归巢于血管新生组织并分化成内皮细胞的一群干/祖细胞，是血管内皮细胞的前体。EPC具有内皮细胞特性，能黏附于纤维连接蛋白包被的培养皿，可通过贴壁培养法从单个核细胞中分离培养。笔者实验室已通过流式细胞仪鉴定此法培养的细胞表达EPC公认特异性标志CD34＋/CD133＋/VEGFR-2＋[9]，此次再以Dil-ac-LDL/FITC-UEA -I lectin双荧光染色进一步证实。EPC参与出生后血管新生和内皮损伤后的修复过程，加速内膜损伤血管的再内皮化，并减少新生内膜的形成[10]。动物实验和临床研究均证实，新生血管中25﹪的内皮细胞是由EPC分化而来的[11]。正常情况下内皮损伤与EPC修补之间存在动态平衡，维持着内膜的完整性，然而动脉粥样硬化发生发展的各种危险因素可通过多种途径对循环中EPC的数量和生物学功能造成影响[12]。

吸烟是心血管病的重要危险因素，研究证实BaP可引起内皮的损伤。本实验则发现BaP暴露对内皮祖细胞这个内皮损伤与修复平衡中最重要的角色有损伤作用。在体外诱导试验中，BaP呈剂量依赖性地降低了内皮祖细胞增殖、黏附、迁移及成血管能力。与此同时，细胞培养上清液中SOD的活力也相应降低，似乎提示BaP对EPC细胞功能学的影响与氧化损伤有关。

综上所述，BaP对EPC各种生物学功能的损伤，可能会打破内皮损伤与EPC修补之间的动态平衡，这可能是BaP引起血管壁病变的原因之一。而BaP是香烟烟雾的重要成分，这也提示吸烟这一不良嗜好引起动脉粥样硬化的原因可能与BaP对血管壁的损伤有关。有关BaP对EPC各种生物学功能损伤机制的深入研究有利于相应抑制方案的筛选，这对于烟民众多且尾气污染日重的现状有其深刻意义。

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