寻常性银屑病患者外周血Th17/Treg平衡偏移的研究

陈晋广 ，赖维 ，姜昱

（1.广东省中山市人民医院，中山528403；2.浙江省台州市立医院，台州318000；3.中山大学附属第三医院，广州510630）

银屑病是一种治疗困难、危害大、复发率高的顽固性皮肤病。近年来大量研究发现，天然免疫而不是获得性免疫在银屑病的发病机制中起到更为重要的作用，天然免疫是机体免疫防御的首要防线,可能比特异性免疫紊乱对银屑病的发病具有更关键的作用。目前调节性T细胞（regulatory T cell,Treg）在天然免疫紊乱中的作用成为研究的一大热点。介导免疫耐受的Treg和介导炎症反应的Th17细胞均来源于初始T淋巴细胞，两者的分化过程和功能相互拮抗维持动态的平衡,从而维持机体的免疫稳定。笔者前期研究发现，辅助性T细胞17（T helper 17 Cells,Th17）相关细胞因子人白细胞介素-17（human interleukin-17）、IL-23在银屑病患者外周血中表达明显高于正常人群，提示Th17功能失常参与了银屑病发病过程[1]；本研究基于前期研究，对患者外周血Th17、Treg细胞的表达进行检测，探讨Th17/Treg的平衡偏移以及在其发病中的作用，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 病例资料 46例寻常性银屑病患者来自2012年1月—2012年10月本院皮肤科门诊和住院患者。其中静止期21例（男12例,女9例；年龄19～51岁，病程 8～10.5年），进行期 25例（男13例，女12例；年龄18～50岁，病程8.5～11年）。银屑病患者病情严重程度按照PASI[2]积分法评分并记录。20例正常对照组来自本院门诊献血员（男11例，女9例；年龄18.5～48岁）。2组患者年龄、性别差异无统计学意义。所有研究对象对实验知情同意，实验经医院医学伦理委员会批准。

1.2 排除标准 患者近半个月内接受过免疫抑制剂、糖皮质激素及光疗等相关治疗；伴有心脑血管、肝、肾等疾病及免疫性疾病和内分泌等系统性疾病的患者。

1.3 Th17细胞和CD4+CD25+Treg细胞亚群检测所有研究对象于清晨空腹抽取外周静脉血5 mL，肝素进行抗凝，采用淋巴细胞分离液以聚蔗糖（ficoll）密度梯度法分离出外周血淋巴细胞,磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS；含 1%小牛血清）冲洗,制备淋巴细胞悬液（浓度1×109/L）。取淋巴细胞悬液置于 48孔培养板内,每孔 1 mL,加 50 μg/L佛波酯、1 mg/L离子霉素和莫能菌素2 μmol/L,孵箱（德国 HERAEUS公司，37℃、5%CO2） 中培养 5 h。收集细胞分为实验管和对照管，加入20 μL PE-Cy5标记的鼠抗人CD4单抗 （美国e Bioscience公司）混匀,放置20 min（室温、避光），对细胞表面抗原进行染色。加200 μL Cytofix/Cytoperm液,在4℃下放置20 min，通透和固定细胞，洗涤。实验管分别加入10 μL FITC标记的鼠抗人 CD25抗体（美国 e Bioscience公司）、FITC标记的IL-17抗体（美国e Bioscience公司），对照管加入同型对照抗体,孵育30 min后（4℃、避光）,用 Perm/Wash液1 mL洗涤 2次，以300 μL洗涤液重悬细胞，采用流式细胞仪（EPICS-XL COULTER）于24 h内检测分析。以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4＋），最终以散点图IL-17、CD25染色阳性分别表示 Th17细胞和 Treg细胞，数据用Cellsquest软件分析。

1.4 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件包分析。Th17与Treg细胞数量比较用Mann-Whitney检验；用Spearman建立Th17/Treg与PASI之间的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 银屑病患者Th17/Treg表达与对照组的比较进行期、静止期银屑病患者外周血中Th17细胞表达均明显高于对照组（P<0.05），进行期表达水平高于静止期患者（P<0.05）；2组患者Treg细胞表达与正常组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。进行期Th17/Treg明显高于对照组和静止期（P<0.05），静止期患者 Th17/Treg高于对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 Th17、Treg表达患者PASI相关性分析 银屑病患者外周血中Th17的表达与PASI呈正相关（rs＝0.421，P＜0.05）；Th17/Treg 与 PASI 呈正相关（rs＝0.502，P＜0.05）；Treg 与 PASI无明显相关性（P＞0.05）。

表1 银屑病患者Th17、Treg表达与对照组的比较

3 讨论

在不同的条件和抗原刺激的信号中，初始CD4+T淋巴细胞可分化成多种亚型的T淋巴细胞，包括Th1/Th2型、Th17/Treg型，发挥相应的生物学效应[3]。其中，Th17/Treg细胞是近年来发现的CD4+T新亚型，具有与Th1/Th2不同的独立分化途径，成为目前免疫学研究的热点之一。Th17细胞在中性粒细胞的动员、募集、活化和介导促炎反应中起到重要的作用；Treg细胞在功能上和分化过程中与Th17细胞相互对抗，对机体自身反应性T细胞以及一些效应性T细胞活化具有选择性抑制效应；正常生理状态下两者保持动态平衡。近年来随着对Th17、Treg细胞研究的深入，使人们对许多自身免疫性疾病发病机制有了新的认识。越来越多证据表明，两者在多种自身免疫性疾病、炎性疾病、肿瘤和感染性疾病的发生发展中起到重要的作用。在银屑病小鼠模型研究中发现，CD4+CD25+Treg细胞功能受损及IL-23/Th17途径细胞因子水平增高[4]，提示Th17/Treg参与了银屑病的发病过程。

本研究显示，Th17细胞在银屑病患者外周血中表达水平明显升高。Chan等[5]在小鼠皮内分别注射IL-23、Th1分化的关键细胞因子IL-12，经注射IL-23后诱导产生的炎症性病理表现与银屑病皮损更为接近，研究认为Th17细胞可能是产生银屑病皮损病变的主要启动者。笔者本次研究还发现，银屑病患者外周血中Treg细胞与正常对照组比较差异无统计学意义。由此推测，Th17细胞呈表达状态，而患者Treg不能伴随Th17细胞升高而上升，势必导致患者Th17/Treg比值的升高。Zhang等[6]研究发现，银屑病患者皮损处Th17/Treg比例与PASI积分呈负相关，而循环中Th17/Treg的比例与PASI分数呈正相关。笔者本次研究显示，银屑病患者外周血中Th17的表达与 PASI呈正相关，Th17/Treg与PASI呈正相关，与Zhang等[6]报道一致。提示，银屑病Th17/Treg变化水平可能为今后临床评估患者病情提供又一客观指标。近年来随着Th17/Treg研究深入，开展了许多针对性治疗的实验研究。抗肿瘤坏死因子拮抗剂依那西普能够逆转Th1/Th17细胞的活化，从而上调Th2、Treg亚群，达到治疗银屑病的目的[7]；临床研究发现，纠正银屑病患者Th17/Treg的失衡有望成为新的药物治疗靶点[8]。因此，通过Th17/Treg失衡的研究不仅解释或完善银屑病部分发病机制，而且可能在临床上为银屑病临床治疗提供新方向。

[1]陈晋广，杨志波.“血分论治”治疗寻常性银屑病患者外周血白介素17和白介素23的变化 [J].中华皮肤科杂志,2012,45（2）:67-68.

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[3]Sallusto F,Lanzavecchia A.Heterogeneity of CD4+memory T cells:functional modules for tailored immunity[J].Eur J Immunol,2009,39:2076-2082.

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[5]Chan JR,Blumenschein W,Murphy E,et al. IL-23 stimulates epidermal hyperplasia via TNF and IL-20R2-dependent mechanisms with implications for psoriasis pathogenesis[J].J Exp Med,2006,203:2577-2587.

[6]Zhang L,Yang XQ,Cheng J,et al.Increased Th17 cells are accompanied by FoxP3（＋）Treg cell accumulation and correlated with psoriasis disease severity[J].Clin Immunol,2010,135:108-117.

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[8]陈晋广，赖维，姜昱.“血分论治”对寻常型银屑病患者Th17/Treg影响的研究[J].中国医师杂志,2012,14（8）:1027-1028.