一种适用于RT-PCR的石榴籽粒总RNA提取方法

黄有凯，曹丹琴，彭媛媛，龚凌燕，张水明

(1.安徽农业大学园艺学院，合肥230036;2.合肥一中，合肥230036)

石榴(Punica granatum L.)为石榴科石榴属多年生落叶果树，又名安石榴、若榴。石榴色泽艳丽，外形美观，籽粒晶莹，味美多汁，富含营养，很受欢迎。因其具有较高的经济价值，近年来，中国学者已针对石榴进行了品种改良和选育等工作。

分子生物学中，高质量 RNA的提取是进行cDNA文库建立、Northern杂交、基因克隆及差异表达分析等分子生物学实验的基础［1］。常用的提取植物 RNA的方法有很多，如 SDS-酸酚法，异硫氰酸胍法，CTAB法、Trizol reagent kit法等，这些方法均能提取出石榴籽粒RNA，但效果欠佳且异硫氰酸胍和 Trizol试剂比较昂贵。针对石榴籽粒中含有蛋白质、多糖、酯类等物质的干扰，对比各种提取方法特点和效果，本着经济，简便且高效的原则，本研究在原有的 CTAB法基础上进行了改良，成功获得了高质量的总RNA。在此基础上通过反转录、PCR试验成功扩增了预期大小的Actin基因片段，此方法得到的石榴籽粒总 RNA可满足 cDNA、RT-PCR等分子生物学研究，为石榴的分子生物学研究奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料

从怀远采集的“红玉石籽”石榴品种，剥取石榴籽粒若干，用液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存备用。

1.2 方法

1.2.1 石榴籽粒总RNA的提取

针对石榴籽粒富含多糖、酚类、蛋白质等杂质的干扰，在一般 CTAB法［2-4］的基础上进行改良，具体操作步骤如下:

取4支2 mL离心管，分别加入1 mL 2%CTAB抽提液，65℃水浴预热10 min;取适量红玉石籽石榴籽粒，加入液氮研磨至粉末状，迅速均匀转入离心管中，充分混匀，65℃水浴30 min，每5 min摇晃1次;4℃下12000 r/min离心10 min;取上清液于新的2 mL离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)抽提，上下颠倒混匀，4℃下12000 r/min离心10 min，反复抽提两次;取离心后的上清液于新的2 mL离心管中，加入1 mL无水乙醇，离心收集沉淀，用 DEPC处理水溶解，搅拌，根据溶液体积加入 1/4体积10 mol/L LiCl使LiCl终浓度为2 mol/L，-20℃下过夜析出沉淀;4℃，12000 r/min离心10 min，收集沉淀，用70% 乙醇清洗沉淀后用 DEPC处理过的 20 μL水溶解，-80℃保存备用。

1.2.2 总RNA质量检测

取5 μL RNA产物进行1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外透射仪下观察RNA条带，分析总RNA的完整性;另取5 μL RNA产物利用 DU-800紫外分光光度计测其260 nm和280 nm的 OD值，计算 OD260/OD280。

1.2.3 RT-PCR检测

以 1 μg总 RNA为模板，按照 TaKaRa公司的M-MLV RNase cDNA Synthesis Kit说明书逆转录合成cDNA第一链，将产物稀释20倍作为 PCR反应的模板。PCR反应所用引物来源于 Genbank上已知的Actin基因序列［5］，引物序列为上游引物 ActinF:5'CAATGTGCCTGCCATGTATG3'，下游引物 ActinR:5'CCAGCAGCTTCCATTCC AAT3'。PCR反应体系为模板 1 μL、Taq DNA 酶 0.25 μL、Actin 上下游引物 各 1 μL、dNTP 1 μL、Mg2+2.5 μL、10 × buffer 2.5 μL，加 ddH2O至25 μL。反应条件为:94℃预变性3 min;94℃ 30 s;58℃ 35 s;72℃ 90 s，共35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外透射仪下观察并照相记录。

2 结果与分析

2.1 总RNA质量分析

石榴籽粒总RNA的质量对后续反转录反应的影响较大，纯度高和完整性好的RNA的28S和18S条带清晰明亮，28S条带荧光亮度是18S条带的1.5～2.0倍，且 RNA的 OD260nm/OD280nm应介于 1.8～2.0之间［6］。凝胶电泳是检验 RNA质量的一种重要手段，从电泳图上不仅可以判断出RNA的完整性和降解度，也可以判断出是否有 DNA、蛋白质和多糖等杂质的污染［7］。以石榴籽粒为材料提取总 RNA，1.0% 凝胶电泳检测结果显示，28S、18S两条条带清晰且28S rRNA的亮度约为18S rRNA的2倍，背景较干净(图1)，表明该试验提取的RNA完整性较好。用DU-800紫外分光光度计测得的 OD260nm/OD280nm为 1.9960，介于1.8～2.0之间，纯度较高。表明用改良 CTAB法提取出的石榴籽粒基本没有蛋白质和DNA的污染，可用于后续分子生物学试验。

图1 改良CTAB法提取石榴籽粒总RNA电泳结果Fig 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA with modified CTAB method

2.2 RT-PCR结果分析

由于反转录对 RNA纯度要求很高，高质量的RNA对于全长 cDNA文库的构建非常重要。为了进一步检测石榴籽粒总RNA的质量，将RNA反转录合成 cDNA第一链，以其为模板，ActinF和ActinR为上下游引物，进行PCR扩增，预期片段大小为500 bp左右，结果显示在500 bp附近有一条亮带(图2)，符合预期目的片段大小，条带清晰，背景干扰小，说明反转录成功，所提取的RNA完整性好，纯度较高，可以进行后续RT-PCR等分子生物学试验的研究。

图2 石榴籽粒Actin基因PCR扩增产物Fig 2 PCR product of Actin from seeds of pomegranate

3 讨论

通过上述改良CTAB法对石榴籽粒总 RNA进行提取并检测获得了质量较高的RNA。石榴籽粒中含有多糖、蛋白质、酯类等物质的干扰，多糖与RNA的理化性质相似，抽提过程中容易与RNA形成难溶的胶状物沉淀［8，9］，以致 RNA 产率低、纯度不高，在改良CTAB法中，经过两次氯仿/异戊醇抽提，再加入少量无水乙醇沉淀，有效地去除了多糖、蛋白质类物质影响［10］，抽提过程中用氯仿而不用苯酚，既可除去蛋白质又避免了苯酚对mRNA的破坏。2 mol/L LiCl过夜沉淀可以去除 DNA污染并减少 RNA的降解几率，LiCl本身沉淀大RNA效果好的特点使得到的RNA大片段损失很少，更适合用于后续的分子生物学实验，同时LiCl也可以使部分多糖留在溶液中而不随RNA沉淀下来［11］。试验中也尝试采用 Trizol reagent kit法、异硫氰酸胍法、一般CTAB法等方法提取 RNA，但 Trizol法提取的RNA产量过低且Trizol试剂价格昂贵，异硫氰酸胍法未能有效去除多糖、蛋白质等物质，一般CTAB法提取的 RNA中 DNA污染严重［12］，而改良CTAB法能较简单、经济、高效地解决石榴籽粒总 RNA提取中所遇到的问题。

Actin是一种广泛参与真核细胞生理过程的重要基因，在基因表达调控研究时被广泛用作分子内标［13，14］，内标基因一般是在不同的处理条件下表达相对稳定的管家基因。肌动蛋白(Actin)普遍存在于真核细胞中，该基因的表达具有稳定性，在物种内各组织中保持相对恒定的表达水平，常在定量、半定量 RTPCR、Northern杂交实验中被用作内参基因校正样本量［15］。为进一步验证提取的石榴籽粒总RNA能否用于后续分子生物学实验，以 Actin基因为鉴定的对象，通过RT-PCR进行验证，得到一条单一的Actin基因片段，且条带大小符合预期片段大小，表明获得的 RNA较好，可用于后续分子生物学分析。

本试验采用改良 CTAB法所提取到的“红玉石籽”石榴籽粒总RNA经检测完整性较好，纯度较高，该方法对富含多糖、蛋白质、酯类等次生代谢物的植物材料总RNA的提取具有借鉴意义。

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