磷酸三酯酶的同源模建及分子对接理论

郑文琦,赵 丽,宋亚伟,韩葳葳

(1. 吉林建筑工程学院 基础科学部,长春 130118；2. 吉林大学 分子酶学工程教育部重点实验室,长春 130012)

有机磷农药是一种广泛使用的高效杀虫剂,但其严重污染土壤和地下水,导致生物物种减少和灭绝,破坏生态平衡. 而且大多数有机磷农药为神经毒素,对人等非靶标生物会产生直接或间接的毒性效应[1-2]. 目前,微生物降解是清理有机磷农药残余最安全高效的方法. 磷酸三酯酶样内酯酶(phosphotriesterase-like lactonases,PLLs)是降解有机磷毒剂最主要的酶类,具有降解磷酸三酯和内酯的双重功能[3],文献[4]报道了其降解活力,文献[5-6]将其定义为一个新的酶类. 但大多数PLLs磷酸三酯酶活力较低. 本文以来源于Thermaerobactermarianensis的磷酸三酯酶为研究对象[7],利用同源模建和分子动力学模拟方法建立蛋白三维结构,通过与磷酸三酯底物和内酯底物对接的研究,确定了形成复合物起重要作用的氨基酸残基.

1 实 验

1.1 理论方法 同源模建采用3D-JIGSAW服务器. 来源于Thermaerobacterm的磷酸三酯酶包含331个残基(NCBI Reference Sequence: YP_004102636.1 EC 3.1.1.8),通过3D-JIGSAW建模建立其三维结构. 先利用Amber全原子力场和GROMACS4.3.1软件对其进行分子动力学优化[8],再经过7 ns 分子动力学模拟优化其结构.

1.2 分子对接 先在已知晶体结构的磷酸三酯酶样内酯酶中找到包含配体结构N-丁酰基-DL-高丝氨酸内酯(PDB code 3ojg),再根据配体在活性中心的位置设定中心坐标,将TsPLLs和3ojg的坐标重叠,使用已设定的中心坐标和BOX,利用Autodock软件对不同的底物进行对接,并根据配体的不同构象、 方向及位置进行评分和排序后,使用CDOKER软件对最适底物进行柔性对接,以研究酶与底物结合时的重要残基. 金属离子采用Zn2+.

2 结果与讨论

通过NCBI的BLAST搜索可知,TmPLLs同源性最高(61%)来源于Geobacillus Stearothermophilus Strain 10的有机磷水解酶(PDB code 3F4D[9]),其序列对比如图1所示.

图1 TmPLLs的序列对比Fig.1 Sequence alignment of TmPLLs

图2 TmPLLs的RMSDFig.2 RMSD of TmPLLs

TmPLLs结构由3D-JIGSAW软件在线构建,构建的结构包含331个残基. 图2为TmPLLs通过Gromacs 软件包进行7 ns分子动力学模拟的均方根偏差(RMSD). 由图2可见,经过5 ns的动力学模拟,酶的体系已经稳定,RMSD约为0.17.

利用Profile-3D评估优化后的结构,其分值为136.09,接近最高得分150.74,远高于最低得分67.83. 使用MolProbity[10]评估二面角,其91.5%残基的二面角在允许范围内. 因此,TmPLLs的结构可靠.

磷酸三酯酶样内酯酶具有磷酸三酯酶和内酯酶的双重功能[9]. 为验证TmPLLs的底物选择性,本文进行分子对接研究， 先根据已知带有配体的结构(PDB code 30jg)设置BOX . 表1为磷酸三酯酶样内酯酶和N-丁酰基-DL-高丝氨酸内酯的对接能量得分. 由表1可见,BOX设置为44最合适.

表1 磷酸三酯酶样内酯酶和N-丁酰基-DL-高丝氨酸内酯的对接能量得分Table 1 Docking score between TmPLLs and N-butyryl-DL-homoserine lactone

将TsPLLs和3ojg的坐标重叠,在已经设定的中心坐标和BOX(44)上分别使用3种磷酸三酯底物(乙基对氧磷,甲基对氧磷和内吸磷-S)和3种内酯底物(γ-壬内酯,δ-十一内酯和N-高丝氨酸内酯),通过Autodock 4.2软件进行分子对接研究,结果列于表2. 由表2可见：3种磷酸三酯底物中,乙基对氧磷和酶的结合自由能最低;3种内酯底物中,γ-壬内酯和酶的结合自由能最低.

表2 结合自由能的计算结果Table 2 Free binding energies calculated

为进一步确定磷酸三酯底物和内酯底物活性位点的重要氨基酸残基,使用CDOCKER软件对乙基对氧磷和γ-壬内酯柔性对接,活性位点残基用文献[9]报道的Phe28,Cys74,Tyr99,Tyr100,Val268，Trp271,Arg230,Ile233,Phe236，Val237,Trp289.

图3为γ-壬内酯与酶结合时的重要氨基酸残基,包括Phe28,His25,Arg44,Arg76,His34,Ile233,Arg230,Phe236,Ser235,Asp266,Trp289,Ser267,Asn269,Val268. 其中Arg44和His25与底物形成的氢键如图4所示. Phe28,Arg230和Phe236是活性点的重要氨基酸残基,与文献[10]结果一致.

图3 γ-壬内酯与酶结合的氨基酸残基Fig.3 Active residues of TmPLLs-γ-nonanoic lactone complex

图4 γ-壬内酯与His25,Arg44形成的氢键Fig.4 Hydrogen bonds between γ-nonanoic lactone and His25,Arg44

图5为乙基对氧磷与酶结合时的重要氨基酸残基,包括His25,Phe28,His34,Arg44,Gly102,His178,Arg230,Ile233,Phe236,Val268,Asp266,Asn269,Trp289. 其中Arg44,Arg230和底物形成2个氢键,如图6所示. 由图3～图6可见,Arg44是底物(磷酸三酯和内酯)与酶结合时的重要氨基酸残基,这是因为Arg44与不同的底物均可形成氢键,而氢键在酶催化活动中的作用较大,可使复合物的体系稳定,为定点突变实验提供可靠线索.

图5 乙基对氧磷与酶结合的氨基酸残基Fig.5 Active residues of ethyl paraoxon-TmPLLs

图6 乙基对氧磷与Arg230,Arg44形成的氢键Fig.6 Hydrogen bonds between ethyl paraoxon and Arg230,Arg44

底物入口残基对酶催化活性的变化具有重要作用. 通过文献[9]和序列对比可知,TsPLLs的入口残基为Tyr100和Val237. 本文构建出PLLs的Y99W突变体,Tyr99邻近入口,与野生型的PLLs比较,突变体酶分子的表面静电势提高,表明疏水性增强,如图7所示. 突变体比野生型入口残基的直径小,如图8所示. 由图8可见,突变体入口残基V237与Y100的直径为20.80 nm,野生型入口残基的直径为22.21 nm. 通过CASTp软件分析活性口袋大小: 野生型为874.9 nm3,突变体为917.3 nm3,可见突变体口袋变大. 上述变化均对酶的催化效率产生有益影响,因此Y99W的突变体可提高酶活力.

图7 野生型PLLs (A)与突变体PLLs (B)的表面静电势Fig.7 Protein contact potentials of WT PLLs (A) and PLLs Y99W mutant (B)

图8 野生型PLLs (A)和突变体 PLLs (B)的入口直径Fig.8 Diameters of entrance gates of WT PLLs (A) and PLLs Y99W mutant (B)

[1] XIANG Dao-feng,Kolb P,Fedorov A A,et al. Functional Annotation and Three-Dimensional Structure of Dr0930 from Deinococcus Radiodurans,a Close Relative of Phosphotriesterase in the Amidohydrolase Superfamily [J]. Biochemistry,2009,48(10): 2237-2247.

[2] Baker P J,Montclare J K. Enhanced Refoldability and Thermoactivity of Fluorinated Phosphotriesterase [J]. Chembiochem,2011,12(12): 1845-1848.

[3] Elias M,Dupuy J,Merone L,et al. Structural Basis for Natural Lactonase and Promiscuous Phosphotriesterase Activities [J]. J Mol Biol,2008,379(5): 1017-1028.

[4] Afriat L,Roodveldt C,Manco G,et al. The Latent Promiscuity of Newly Identified Microbial Lactonases Is Linked to a Recently Diverged Phosphotriesterase [J]. Biochemistry,2006,45(46): 13677-13686.

[5] Elias M,Tawfik D S. Divergence and Convergence in Enzyme Evolution: Parallel Evolution of Paraoxonases from Quorum-Quenching Lactonases [J]. J Biol Chem,2012,287(1): 11-20.

[6] Merone L,Mandrich L,Porzio E,et al. Improving the Promiscuous Nerve Agent Hydrolase Activity of a Thermostable Archaeal Lactonase [J]. Bioresource Technology,2010,101(23): 9204-9212.

[7] Han C,GU Wei,ZHANG Xiao-jing,et al. Complete Genome Sequence ofThermaerobactermarianensisType Strain [J]. Stand Genomic Sci,2010,3(3): 337-345.

[8] ZHAN Dong-ling,WANG Song,HAN Wei-wei,et al. Study of Homology Modeling and High-Throughout Screening of a New Inhibitor of Panaxβ-AS [J]. Acta Chim Sinica,2012,70(3): 217-222. (詹冬玲,王嵩,韩葳葳,等. 人参β-香树素合成酶同源模建及高通量虚拟筛选抑制剂的研究 [J]. 化学学报,2012,70(3): 217-222.)

[9] Hawwa R,Aikens J,Turner R J,et al. Structural Basis for Thermostability Revealed through the Identification and Characterization of a Highly Thermostable Phosphotriesterase-Like Lactonase fromGeobacillusstearothermophilus[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics,2009,488(2): 109-120.

[10] Davis I W,Leaver-Fay A,Chen V B,et al. Mol Probity: All-Atom Contacts and Structure Validation for Proteins and Nucleic Acids [J]. Nucleic Acids Research,2007,35: 375-383.