抑制瘤胃甲烷排放的酵母菌的筛选及培养条件优化

公衍玲， 廖新俤

(华南农业大学 动物科学学院，广东 广州 510642)

益生菌可通过直接饲喂来调节宿主动物的肠道菌群平衡，进而提高生产性能、改变瘤胃发酵和提高营养物质的利用率[1]。直接饲喂微生物中最常见的真菌培养物是酿酒酵母和米曲霉，目前酵母菌在反刍动物饲料中应用比较广泛。研究发现酵母菌还具有抑制瘤胃甲烷排放的作用[2]，且作用机制已有大量研究：增加丙酸和丁酸的含量[3]；减少原虫动物的数量[4]；增加产乙酸菌的数量[5]。甲烷是反刍动物瘤胃正常消化的产物，但其排放不仅对空气环境造成污染，增加温室效应，并且造成饲料能量的损失。因此，减少反刍动物瘤胃内甲烷的生成量对提高饲料能量利用率和改善环境都具有重要的意义。Newbold 和Rode[6]研究发现，酵母菌对瘤胃发酵产甲烷的调控具有很强的菌株效应，有些菌株无调控效应，有些菌株可使甲烷的产量降低58%。因此，本研究以酒、面包和畜禽专用酵母为原料，分离到了3株酵母菌，然后通过体外发酵试验，从中筛选到1株抑制瘤胃甲烷排放效果最为显著的酵母菌YST 3，并以此为研究对象，对该菌株进行了分子生物学鉴定；测定了其生长曲线；并对其发酵培养基和培养条件进行了优化。旨在初步筛选抑制瘤胃甲烷排放的酵母菌株，并优化其最佳培养条件，为下一步直接添加研究其调控瘤胃甲烷排放效果及相关机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要材料 用于菌种分离的酒和面包均购自马来西亚吉隆坡的农贸市场。畜禽专用活性干酵母，购自安琪酵母股份有限公司，活菌数≥200亿个/克。瘤胃液采自经长期稳定饲养且安装永久性瘘管的2 头泌乳荷斯坦奶牛，39 ℃恒温密封保存。

1.1.2 培养基 YPD培养基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，若制固体培养基，加入2%琼脂粉，pH值自然，121℃蒸汽灭菌20 min。

1.1.3 主要试剂 0.9 %生理盐水：NaCl0.9 g，加蒸馏水定容至100 mL。

常量元素溶液：Na2HPO45.7 g；KH2PO46.2 g；MgSO4·7H2O 0.6 g，加去离子水定容至1 000 mL。

微量元素溶液：CaCl2·2H2O 13.2 g；MnCl2·4H2O 10.0 g；CoCl2·6H2O 1.0 g；FeCl2·6H2O 0.8 g，加去离子水定容至100 mL。

缓冲溶液：NH4HCO34.0 g；NaHCO335.0 g，加去离子水定容至1 000 mL。

刃天青溶液0.1%(w/v)：刃天青100 mg，溶解于100 mL去离子水中。

还原剂溶液(现配现用)，1N NaOH 2.0 mL；Na2S·7H2O 285 mg；加去离子水定容至50 mL。

DNA抽提试剂盒：i-genomic BYF DNA Mini Kit，Omega公司，美国。

胶回收试剂盒：E.Z.N.A Gel Extraction kit，Omega公司，美国。

1.1.4 试验设备 超净工作台(AIRTECH)，高压蒸汽灭菌锅，冻干机(CHRIST)，ZHWY-2102C系列震荡培养箱，7200型紫外可见分光光度计，100 mL 玻璃注射器(HBERLE, 德国)，水浴摇床(SHA-B)，岛津GC-2010型气相色谱仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离 以无菌操作取酒/面包/安琪畜禽专用活性干酵母样10 mL/10 g/10 g，放于装有90 mL灭菌生理盐水(0.9 %)的灭菌三角瓶瓶内，充分混匀制成1∶10的均匀稀释液。用1 mL灭菌吸管吸取1∶10稀释液1 mL，沿瓶壁缓缓注入含有9 mL灭菌生理盐水的灭菌三角瓶瓶内，混合均匀，制成1：100的稀释液。另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制成10倍递增稀释液(10-2to 10-6)。从每个稀释液中分别取100 μL，对号接种在不同稀释度编号的YPD固体培养基平板上(每个编号设三个重复)。将平板倒转，于30 ℃恒温培养箱中培养72 h。待培养基上长出明显菌落后，每组分别挑取20个具有典型酵母菌菌落特征的单菌落，接种于YPD固体培养基平板上，再培养72 h，获得纯培养样品。

挑取纯培养样品的单菌落，接种于50 mL YPD液体培养基中，30℃、175 r/min震荡培养48 h。取扩大培养的菌液，9 600 g离心10 min，去掉上清液，细胞沉淀用双蒸水清洗2次。收集细胞沉淀，冻干机冷冻制成冻干粉，分别标记为YST1(安琪酵母样)、YST2(酒样)和YST3(面包样)，每克冻干粉含有的活菌数约为1.8 × 1010CFU。

1.2.2 菌株鉴定 收集4 mL纯培养酵母样品，采用i-genomic BYF DNA Mini Kit抽提DNA，用于18s rRNA扩增。基因上游引物ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT TGC GG-3')，基因下游引物 ITS 2(5'-GCT GCG TTC TTC TTG ATC GAT GC-3')。50 μL PCR反应体系：2 μL DNA 模板，2.0 μL 上/下游引物，4.0 μL dNTPs，1.0 μL EX Taq，5.0 μL 10 × buffer和 34.0 μL ddH2O。混合均匀后，按以下条件进行PCR反应：95℃ 1 min，60 ℃ 45 s，72℃ 45 s ，35个循环，最后72℃延伸10 min。反应结束后，50 μL PCR 产物进一步用E.Z.N.A Gel Extraction kit进行胶回收，将胶回收产物送往北京奥莱博生物技术有限责任公司测序，序列的遗传多样性采用DNAMAN 4.0软件进行分析。

1.2.3 体外发酵 以500 mg苏丹草作发酵底物，采集经长期稳定饲养且安装永久性瘘管的2 头泌乳荷斯坦奶牛瘤胃液做发酵菌源，接种液的配制参照Menke和Steingass[7]，将发酵菌源与接种液按照1∶2比例混合均匀，即为体外发酵液(30 mL/支注射器)，厌氧保存。体外发酵装置为100 mL的玻璃注射器(HBERLE, 德国)，用前用凡士林润滑活塞。

采用单因素试验设计将试验分为4个处理：对照组、YST 1组、YST 2组及YST 3组。对照组未添加酵母粉，活性干酵母组的酵母粉添加剂量为：0.2 mg/mL发酵液。每个处理6个重复，每个重复3支注射器。于39℃水浴摇床中60 r/min培养24h。

记录第0 h的活塞位置读数，根据活塞位置记录累积产气量。第24 h终止发酵，用50 mL注射器采集气样，转移至气体采样袋中，用岛津GC-2010型气相色谱仪测定甲烷浓度，条件是：色谱柱为美国AgilentHP-PLOT Q毛细柱，长30 mm、内径0.32 mm、薄膜厚度0.25 μm、柱温50 ℃，进样口SPL温度250 ℃，检测器FID温度250 ℃。压力92.8 kPa，空气流量400 mL/min；氢气流量40 mL/min，氮气(载气)流量60 mL/min，进样体积200 μL，分流比6∶1。筛选抑制瘤胃甲烷排放效果显著的酵母菌株。

1.2.4 生长曲线测定 以2%的接种量(体积分数，下同)将酿酒酵母菌株YST 3接种于50 mL YPD液体培养基中(pH 5.5)，30℃、175 r/min震荡培养，每隔4 h取菌体悬浮液5 mL，以未接种的酵母YPD液体培养基校正7200型紫外可见分光光度计的零点，测定菌液的OD600值，至OD600变化趋缓为止。根据酵母菌CFU数(涂布平板法)和OD600绘制酵母的生长曲线[8-9]。

1.2.5 培养条件优化 培养温度。以2%的接种量将对数生长期的酵母种子液YST 3接入50 mL YPD液体培养基中(pH 5.5)，分别在25、30、35、40℃下，175 r/min震荡培养24 h后测定菌液的OD600值，确定酵母生长的最适温度。

pH。以2%的接种量将对数生长期的酵母种子液YST 3接入50 mL YPD液体培养基中，调节菌液pH分别为4.5、5.0、5.5(自然配置)、6.0、6.5、7.0，30℃、175 r/min震荡培养24 h后测定菌液的OD600值，确定酵母生长的最适pH。

葡萄糖浓度。分别调节50 mL YPD液体培养基中的葡萄糖浓度为2.0、3.0、4.0、5.0 %，30 ℃、175 r/min震荡培养24 h后测定菌液的OD600值，确定酿酒酵母YST 3生长的最适葡萄糖浓度。

2 结果与分析

2.1 酵母菌株鉴定

用DNAMAN 4.0软件对三株酵母菌(YST 1 分离自畜禽专用活性酵母；YST 2 分离自酒中；YST 3 分离自面包中)的部分18s rRNA序列(411 bp)进行同源性分析(见图1)，结果发现，三株酵母菌均属于酿酒酵母，且具有91%的同源性；从酒和面包中分离得到的2株酵母与从畜禽专用活性干酵母粉中分离得到的酿酒酵母具有72%的同源性。

2.2 抑制产甲烷作用

三种酵母菌24 h发酵的累计产气量结果见图2。从图2可以看出，发酵24 h畜禽专用酿酒酵母YST 1组的总产气量最高，从酒中分离的酿酒酵母YST2次之，从面包中分离的酿酒酵母YST3最低。发酵24 h添加酵母组的总产气量均高于对照组，但差异不显著(P>0.05)。推断添加酵母菌可能提高瘤胃的整体发酵水平，从而提高了总产气量。

从图3可以看出，与对照组相比，处理组均降低了发酵24 h的甲烷产量。YST 1和YST 2添加组的甲烷产量分别下降4.5%和3.7%(P>0.05)；YST3添加组的甲烷产量下降14.6%(P<0.05)。和对照组相比，YST3显著降低了甲烷的产量，而总产气量变化不大，推断YST3可能通过增加瘤胃发酵过程中的丙酸含量；抑制原虫产甲烷菌的繁殖，以及增加产乙酸菌的数量等途径降低甲烷的产量，但对干物质的消化率没有影响。

图1酵母菌株鉴定
Fig. 1 Identification of the yeasts

图2 体外发酵24 h总产气量Fig. 2 Total gas production after 24h in vitro incubation

图3 体外发酵24 h甲烷产量Fig. 3 Methane production after 24h in vitro incubation

2.3 酿酒酵母的生长曲线

酿酒酵母YST 3的生长曲线见图4,由图4可以看出，在前8 h酵母生长处于停滞期，在8～24 h酵母菌处于对数生长期，在培养24 h后，酿酒酵母活菌数达到最大，之后生长趋于稳定，因此可选择培养24 h的酵母作为接种液。

2.4 酿酒酵母生长条件的优化结果

酿酒酵母YST 3菌株生长的最适温度见图5。可以看出，当温度从25 ℃升到30 ℃时菌液的OD600nm值逐渐升高，温度继续升高，菌液的OD600nm值缓慢下降，而当温度高于35 ℃时OD600nm急剧下降，推断高温可能影响了该菌液的代谢酶活性，从而降低其生长量。可见酿酒酵母YST 3的最适生长温度为30 ℃。

图4 酿酒酵母生长曲线 Fig. 4 The growth curve of Saccharomyces cerevisiae

图5 温度对酿酒酵母生长的影响Fig. 5 Effect of tempreture on the growth of saccharomyces cerevisiae

培养基起始pH对酿酒酵母生长的影响见图6。图6结果表明当pH由4.5升高到5.5时，菌液的OD600nm增大，之后随pH的增大菌液的OD600nm逐渐下降。绝大多数酵母生长的最佳pH范围为4～6[10]，pH>6时，菌体生长量显著降低。可见酿酒酵母YST3的最佳pH为5.5。

培养基中添加不同浓度的葡萄糖对酵母生长情况的影响见图7。该图结果表明当葡萄糖浓度为4.0%时菌株的生长量最大，其OD600nm最高。当葡萄糖浓度低于4%时，菌株生长所需糖量不足，菌体生长量下降；高浓度葡萄糖会造成酵母细胞失水，菌体生长亦受到抑制。

图6 pH对酿酒酵母生长的影响
Fig. 6 Effect of pH on the growth of saccharomyces cerevisiae

图7葡萄糖浓度对酿酒酵母生长的影响
Fig. 7 Effect of concentration of glucose on the growth of saccharomyces

3 结 论

本实验通过体外产气法筛选到了一株显著抑制瘤胃甲烷排放的酿酒酵母YST3。对其生长曲线和生长条件进行初步研究发现，该酿酒酵母菌的对数生长期为8～24 h，最适生长温度和pH 分别为30℃和5.5，当培养基中葡萄糖的浓度为4.0%时可获得最大生长量。

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