CDV免疫蛋鸡血清抗体与卵黄抗体的消长规律及其相关性分析

庄金秋，梅建国，姚春阳，沈志强，丁 壮

(1. 吉林大学 畜牧兽医学院，吉林 长春130062；2. 山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州256600)

犬瘟热(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属(Morbillivirus)的犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)感染引起的多种动物发生的一种急性、高度接触性传染病。CD的死亡率可高达80%，素有“毁灭性传染病”之称[1]。CDV能引起大批犬、貂、狐等动物发病，病死率30%～80%，雪貂高达100%[2]。CDV自然感染宿主除食肉目所有8个科外，还扩展到偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物，CDV自然感染的动物范围还有不断扩大的趋势，其危害性也越来越大[3-4]。因此早期、快速的犬瘟热诊治对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业具有重要意义[5]。目前对CD尚无特效的治疗药物和方法，疫苗接种是唯一有效的防制措施。当前国内外使用的常规疫苗多为灭活苗和弱毒疫苗，前者只能诱发体液免疫应答，后者能与强毒一样可以引起体液和细胞免疫反应，但其存在热稳定性差、易受母源抗体干扰及对某些毛皮动物毒力过强等弊端[6]。注射高免血清抗体(IgG)常作为治疗的辅助手段被广泛使用。禽蛋卵黄抗体(IgY)作为一种新型高效的生物防治剂，已被广泛应用于家禽、猪等多种动物疾病的防治[7]。本研究旨在了解蛋鸡对CDV抗原的免疫反应，及其血清抗体和转移卵黄抗体的消长规律及相关性，从而为制备CDV卵黄抗体提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和细胞 CDV弱毒疫苗株，由山东省滨州畜牧兽医研究院保存。Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)和DF1细胞(鸡胚成纤维细胞系)，由本研究院生物资源室提供。

1.1.2 试验动物 蛋鸡20只：购自山东滨州某蛋鸡养殖场，隔离饲养观察一个月后，取临床观察健康，营养良好，产蛋正常，CDV检测阴性的蛋鸡为试验动物。

1.1.3 主要试剂和器材 优级新生牛血清(兰州民海生物)，DMEM干粉培养基和胰酶(1∶250)(Invitrogen)，倒置荧光显微镜(重光Coic)，5%CO2细胞培养箱(SANYO)，胰酶-EDTA消化液(自制)，细胞培养板(Corning)，弗氏完全佐剂和不完全佐剂(SIGMA)，犬瘟热病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒(山东绿都)，ELX800酶标仪(BIO-TEK)，DEM-Ⅲ型自动酶标洗板机(北京拓普)。

1.2 方法

1.2.1 细胞复苏与培养 将Vero细胞和DF1细胞种子冻存管从液氮罐中取出，置37℃水浴中使其迅速融化，2 000 r/min，离心3 min，无菌条件下弃上清，用少量含6%新生牛血清的DMEM细胞生长液悬浮后移入T25细胞培养瓶中，补加入10 mL细胞生长液，置于37 ℃、5 % CO2培养箱中静置培养。待细胞长成完好单层后，用胰酶-EDTA消化液消化，并按1∶3的比率进行传代培养。

1.2.2 病毒接种与收获 取已长成良好Vero细胞和DF1细胞单层的6孔细胞培养板(培养24h左右)各1个，吸弃细胞培养液，每孔加入0.5 mL不加血清DMEM培养基将CDV病毒液按0.2 mL/孔接种5孔，轻轻吹打使其混和均匀，剩余1孔不接种作细胞对照。将培养板置37℃ 5%CO2培养箱吸附60 min。取培养板，吸弃接种液，6孔板每孔加入3 mL含2%新生牛血清的DMEM细胞维持液，将培养板置培养箱继续培养，每天观察细胞病变(CPE)。培养3～5 d后，当70%～80%细胞出现CPE后收获病毒培养物，置-70 ℃冰箱冻存和继续接种传代培养。

1.2.3 病毒效力测定(TCID50) 取已长成良好Vero细胞和DF1细胞单层的96孔细胞培养板，吸弃细胞培养液，将CDV毒株第3代Vero细胞和DF1细胞培养物分别用不加血清DMEM培养基作10倍系列稀释，10-1～10-10稀释度按100 μL/孔各接种8孔，同时设细胞对照2列，将培养板置37 ℃ 5%CO2培养箱继续培养，每日观察CPE并记录，96～120 h停止观察。按Kaber法计算TCID50。

1.2.4 CDV抗原制备 CDV Vero细胞液差速离心法超离(26 000 g/min离心1.5 h)纯化病毒，核酸蛋白分析仪测定纯化病毒的蛋白含量(5 mg/mL)，然后置-70 ℃保存备用。

1.2.5 蛋鸡的免疫 用灭菌生理盐水将纯化抗原稀释成50μg/mL(按蛋白含量)悬浮液，吸取所需的体积数加入等体积弗氏完全佐剂(CFA)，采用匀浆机匀浆乳化后，颈部皮下及胸肌多点注射1.0 mL/只，其病毒蛋白含量25 μg/只作基础免疫。首次免疫10 d和20 d后分别用1.5倍和2倍剂量抗原加等量弗氏不完全佐剂(IFA)匀浆乳化后，胸肌多点注射1.0 mL/只，加强免疫两次。第三次免疫10 d后，以与三免相同剂量抗原(50 μg/只)不加任何佐剂翼下静脉注射强化免疫1次。对照鸡每次用Vero细胞液冻融三次，然后12 000 rpm离心5 min后的上清液，加等量灭菌生理盐水混匀后与试验鸡同时免疫，1.0 mL/只。试验鸡第四次免疫后每隔30 d以2倍三免剂量抗原(即100 μg/只)不加任何佐剂翼下静脉注射强化免疫一次。

1.2.6 鸡蛋与血清的收集及处理 收集免疫前鸡产的蛋，作为阴性对照。首次免疫后开始每隔5 d收集鸡蛋编号，4 ℃保存。每次免疫前和强化免疫后每10 d翅静脉采血，37 ℃静置2 h或4 ℃放置4～6 h，12 000 g/min离心10 min，取上清即为分离血清，编号，即用或-20 ℃保存。

1.2.7 卵黄抗体提取 将蛋壳表面用酒精棉球擦拭清洁表面的污物，75%酒精喷洒消毒。无菌条件下，打开蛋壳，取出蛋黄，测定蛋黄体积。加入2倍量的灭菌PBS(pH7.4)，搅拌均匀后加入等量的氯仿，充分混匀，置室温静置1 h。12 000 g/min离心15 min后，收集上清液，即为卵黄抗体提取液。即用或-20 ℃保存。

1.2.8 卵黄抗体和血清抗体效力测定

1.2.8.1 琼脂扩散法(AGP)测定抗体水平 采用琼脂扩散法测定每次处理的血清(IgG)和卵黄(IgY)的抗体水平。

1.2.8.2 间接ELISA法测定抗体水平 采用犬瘟热病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒测定每次处理的CDV IgG和IgY的抗体水平。

2 结果与分析

2.1 CDV在Vero细胞和DF1细胞上的病变特征

将CDV分别接种在Vero细胞和DF1细胞上均能增殖，并产生特征性的CPE，即细胞融合成较大的圆形合胞体细胞，外观呈现露珠状(见图1)。但在不同细胞上的表现有所不同。在Vero细胞上CPE出现较快，接毒后18～24 h即能看见轻微的CPE，48～60 h时特征性CPE最明显，拉网且形成大的空斑现象比较明显，72 h可收毒冻存备用；在DF1细胞上的CPE出现较慢，36～48 h开始出现病变，96 h才能收毒，露珠样病变多呈现星芒状。

2.2 CDV在Vero细胞和DF1细胞上的病毒效力

CDV在Vero细胞和DF1细胞上的病毒效力经测定并经Kaber法计算，其TCID50平均测定结果见表1。由表1可知，CDV在Vero细胞上的病毒效力比在DF1细胞上的效力高1个滴度，可见，Vero细胞更适合CDV的增殖。

图1 CDV接种Vero细胞和DF1细胞的CPE(100×)Fig.1 CPE of CDV inoculatied of Vero and DF1 cells (100 ×)1.Vero细胞CPE(48 h)；2. Vero细胞CPE(72 h)；3.正常Vero细胞；4.DF1细胞CPE(48 h)；5.DF1细胞CPE(72 h)；6.正常DF1细胞1.CPE of Vero cells(48 h); 2.CPE of Vero cells(72 h); 3.control Vero cells;4.CPE of DF1 cells(48 h);5:CPE of DF1 cells(72 h); 6: control DF1 cells

细胞种类Cell typeTCID50值(0.1mL)Vero细胞Vero cells10-4.250DF1细胞DF1 cells10-3.875

2.3 AGP法测定CDV IgG和IgY的抗体水平

应用AGP测定CDV IgG和IgY的抗体水平，最高结果见图2。图中CDV IgG和IgY抗体分别按2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6倍稀释加入梅花图案周围孔，CDV抗原加入中间孔。其中IgG抗体第1～5孔与中间孔间出现较清晰条带，效价在1∶32以上(见图2-a)。IgY抗体第1～4孔与中间孔间可出现较清晰条带，其抗体水平在1∶16以上，比IgG抗体低1个稀释度(见图2-b)。

2.4 间接ELISA法测定CDV IgG和IgY的抗体水平

提取的CDV IgG和IgY分别经100倍稀释后作为被检样品，应用间接ELISA试剂盒测定其抗体水平，结果见图3。IgY的上升和上下波动的趋势与IgG基本一致，但其出现较IgG迟3～5 d，这可能是IgG逐步转移至蛋黄的结果。IgG均较IgY的滴度高，其最高滴度可达1∶5000以上，IgY的最高滴度可达1∶3000。IgG的高峰期出现在第2次免疫后，第4次免疫后每30 d加强免疫1次可维持较高血清抗体水平。IgY的高峰期出现在三免后，四免后每30 d加强免疫1次可维持其抗体水平，三免后3～5 d可持续收集鸡蛋制备卵黄抗体。

图2 AGP测定CDV IgG和IgY的抗体水平Fig.2 AGP determining the level of antibodies IgG and IgY of CDVa.IgG； b：IgY

图3 ELISA监测CDV IgG和IgY的抗体消长规律Fig.3 ELISA monitoring the dynamics of antibodies IgG and IgY of CDV

3 讨 论

CDV弱毒株具有泛嗜细胞性，能在多种原代细胞和传代细胞系上增殖并产生特征性的露珠样CPE。试验中我们采用Vero细胞和传代系的DF1细胞进行CDV的接种和传代，通过比较发现，CDV在Vero细胞上的CPE出现较早，而且病毒滴度较高，因此选用CDV Vero细胞毒进行浓缩并作为接种病毒抗原。

从抗体产生的规律或动力学来看，体内产生抗体的水平与抗原性质、免疫剂量、免疫间隔时间、注射的次数、引入的途径以及机体的免疫状态有关。根据预备试验的结果，首免采用注射病毒抗原20 μg/只比注射10 μg/只机体产生抗体的滴度要高。首免、二免、三免、四免间隔的时间为7 d或10 d，其产生抗体的时间和滴度差别不大；而间隔14 d产生的抗体滴度虽然高但起伏大而且维持时间不长。四免后抗体维持到20 d仍未下降，40 d后降低明显。因此，试验中我们采用了首免注射CDV抗原25 μg/只和每间隔10 d进行二免、三免和四免的免疫方法，并且四免后以2倍剂量三免抗原接种量，每30 d进行蛋鸡加强免疫1次，抗体能够持续维持较高水平，取得了较好的结果。

由于CDV含有可溶性抗原成分，本试验建立了应用CDV Vero细胞病毒液制备琼脂扩散抗原，血清抗体和卵黄抗体作为被检抗体建立了琼脂扩散试验方法。结果显示血清抗体能达到1∶32以上，卵黄抗体能达到1∶16。虽然琼脂免疫扩散试验只能粗略的对抗体进行测定，灵敏性较差，但不需要特殊仪器，操作简单，适宜在基层临床中推广，特别是毛皮动物养殖场发生疫情时的尽早确诊，从而制订防制措施，具有重要意义。

血清抗体随着加强免疫的进行逐渐上升，三免后峰值达到最高，四免后随着时间的增加逐渐下降，这可能与进入机体内的抗原和原有的抗体发生部分中和有关。由于机体的免疫记忆细胞的作用， 当再次加强免疫后，抗体水平迅速上升，从而达到更高的水平并维持较长时间。卵黄抗体的上升和上下波动的趋势与血清抗体基本一致， 但其出现较血清迟3～5 d，这是血清抗体逐步转移至蛋黄的结果。血清抗体均较卵黄抗体的滴度高，这可能与血清中存在非特异因子有关。根据卵黄抗体的消长规律，卵黄抗体在三免后3～5 d就已达到较高水平，此时即可开始收集鸡蛋制备卵黄抗体。

卵黄抗体制剂作为一种重要生物制品原料，与多抗血清IgG相比，IgY具有诸多优势，如化学性质稳定，产量高，均一性好，不与补体结合，不非特异性结合血清种类风湿因子，不固定葡萄球菌A蛋白等[8-9]，将其作为一种免疫诊断试剂，将极大地提高免疫学检测准确性；而且卵黄抗体具有取材容易、制造简便、使用方便、见效快等优点。在生产实践中，卵黄抗体用于预防、诊断和治疗动物疾病特别是家禽疾病等方面收到了良好的效果，用卵黄抗体防治CD可避免同源或近源带毒和传播疫病的潜在危险，避免动物高免血清在治疗过程中引起的副作用[10-11]。如果抗CDV卵黄抗体对预防和治疗CD能收到较好效果，将有效降低CD的爆发，减少损失，对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业将具有重要意义。

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