天花粉蛋白对HeLa细胞抑制作用的实验研究

谢博超

（南华大学附属第一医院妇产科 湖南 衡阳 421001）

天花粉蛋白（Triehosanthin，TCS）是从葫芦科植物栝楼（一chosanthin kirilouii Maxim）的块根中提取出来的一种单链核糖体失活蛋白（ribosome－indctivating protein，RIP），具有多种生物学效应，主要包括免疫凋节、抗肿瘤、抗病毒等作用。目前，TCS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤和白血病等方面。本实验研究TCS 对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用，并从诱导细胞凋亡的角度探讨其抗癌作用，探讨TCS抗宫颈癌作用及其机制。

1 准备材料及实验方法

1．1 药品及试剂：TCS购自上海金山制药有限公司（1．2g／L），培养基DMEM（GBICO 公司），新生牛血清FBS（四季青），碘化丙啶（PI）及RNA 酶（Simga公司产品），组织基因组DNA 提取试剂盒及DNA Ladder（北京天根生化科技有限公司），DNA 甲基化试剂盒（北京天漠科技开发有限公司），Taq DNA 聚合酶及dNTPMix（Amresco公司）。电泳仪（－C Apparatus Corpora．tion产品），微型凝胶电泳系统（Bio－Rad产品），DY－Ⅲ电泳槽（北京六一仪器厂产品），凝胶成像系统分析仪（上海天能科技有限公司产品）。

1．2 细胞来源及培养：HeLa（人宫颈癌）细胞（为本实验室保存细胞株）。将细胞培养于37℃，5%CO2的湿化细胞培养孵箱中。培养基DMEM 含10%FBS，0．1U／L青霉素，0．1U／L链霉素，取对数生长期细胞待用。

1．3 HeLa细胞生长抑制实验：本实验采用噻唑蓝（MTT）还原法进行：取对数生长期HeLa细胞，用96孔培养板中进行接种（每孔的培养基细胞数为4000个），待培养24h细胞贴壁后，对照组换新鲜培养基。实验组培养基加不同浓度TCS，使终浓度分别为10、20、40、80、160mg／L，置入CO：加入MTT，培养箱内分别培养24，48，72h后，将上清去除每孔加入150DMSO，然后将培养板置于微孔板振荡器上轻度振荡10min，在酶标仪上测定570nm 处光吸收值（OD 值）。取8孔吸收值平均数，按公式细胞抑制率（%）＝（1－实验组平均吸光度值／对照组平均吸光度值）×100% 计算药物对细胞生长的抑制作用。

1．4 细胞周期观察及凋亡检测

1．4．1 DNA 琼脂糖凝胶电泳胰蛋白酶消化收获实验组及对照细胞：l000r／min离心5min，PBS清洗细胞两遍，NP－40 溶液作用细胞沉淀，加入SDS（终浓度l%）及RNase，56℃处理2h，蛋白酶K37℃作用3－5h，加入1／10体积的3M 醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，轻轻振摇后置于一70℃冰箱中过夜，14 000r／min离心15min，将上清去除，用冰冷的70%乙醇漂洗，1．2% 琼脂糖凝胶电泳3－5h，紫外灯下观察并成像。

1．4．2 流式细胞仪检测分别离心收集对照组及实验组细胞：以含0．2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定，在10000r／min条件下离心5min，去乙醇，PBS洗涤两次，将上清去除；加入等体积的细胞裂解缓冲液室温作用下5min，加Rnase A 置37℃水浴中消化30min，离心后再加人1ml PI染色避光染色30min。

1．4．3 取不同浓度TCS（20、40和80 mg／L）分别作用对数生长期HeLa细胞48h后，收集细胞，流式细胞仪测定荧光强度，激发波长488 nm，采用Modfit分析软件进行细胞周期DNA 含量分析及细胞凋亡率检测。

1．5 统计学方法：数据应用SPSS10．0软件包进行统计学分析，计量资料组间比较采用t检验，计量资料以（x±s）表示，细胞周期与凋亡率组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD和SNK 检验。

2 结果

2．1 MTT 法测定TCS对HeLa细胞生长的抑制作用，见表1。

20，40和80mg／l的天花粉蛋白分别作用于Hela细胞后，随着作用时间的延长，细胞的生长抑制率逐渐升高，且抑制率随药物浓度增加而上升，呈一定的剂量、时效依赖性。见表1。

2．2 TCS对HeLa细胞凋亡率的影响：分析TCS作用HeLa细胞48 h后细胞凋亡率的变化，三种TCS浓度作用后分别与对照组比较细胞凋亡率显著增高（P＜0．01）。三种浓度之间比较亦有显著差异（P＜0．01）。由分析数据可得，随着天花粉蛋白药物浓度的增大及作用时间的延长，凋亡细胞的比例增加，表明TCS诱导Hela细胞凋亡具有时间和剂量依赖性。（见表2）

表1 TCS（不同浓度）对HeLa细胞的抑制率

表2 凋亡细胞在各组中的百分比变化及TCS（不同浓度）对HeLa细胞凋亡率的影响

2．3 TCS对HeLa细胞DNA 断裂的影响：经凝胶电泳分析出TCS（不同浓度）对HeLa细胞DNA 的影响，发现其出现断裂的状况，呈现出HeLa细胞凋亡的梯级格局。见图1；对照组的细胞DNA 无断裂现象出现（见图2）。

3 讨论

经本文研究发现，TCS对HeLa细胞增殖有明显抑制作用，呈量效关系。天花粉蛋白是从中草药天花粉（栝楼块根）中分离得到的一种Ⅰ型核糖体失活蛋白质，TCS为247个氨基酸残基组成的单一多肽链，TCS属于RNAN 一糖苷酶型，专一水解核糖体28SrRNA 第4324位腺苷酸的NC糖苷键，从而引起核糖体某些区域构象的改变，影响核糖体的生物学功能，从而发挥肿瘤抑制作用。随着天花粉蛋白的深入研究和应用范围的拓展，其药物开发价值13益引起广泛关注。科研人员对鲜药材植物栝楼的种植，药物的采集、提取、分离纯化以及进一步加工和分子克隆等，都进行了相关研究。当前，作为商品化的天花粉蛋白已在临床使用。商品天花粉蛋白主要从鲜植物体中提取，部分利用分子克隆技术体外表达，但在这些过程中蛋白活力会受到不同程度的影响，其药物效力也将随之改变。

细胞增殖失控和凋亡受阻是肿瘤发生、发展的主要原因，抑制细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的重要手段之一。TCS能诱导HeLa细胞凋亡，且TCS浓度与凋亡率之间存在量效关系。有研究表明，天花粉蛋白具有核酸内切酶功能，能够切割细胞DNA 超螺旋结构，导致细胞损伤。另外，TCS可能通过与受体结合，引起细胞内信号途径的激活或抑制，从而导致细胞凋亡。

细胞凋亡是细胞生长发育过程中发生的一种极其复杂的生理变化过程，经研究发现肿瘤的发生与细胞凋亡的紊乱调节性密切相关。有很多资料发现，很多的抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡从而达到治疗的目的，所以有效的诱其肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的新方法之一。天花粉蛋白是一种新型的有效的专一的抗肿瘤药物，与一般的化疗药物不同，一般的化疗药物会造成肿瘤和正常细胞全部凋亡，TCS对人的外周血淋巴细胞、T 细胞等正常细胞影响很小，所以相对于一般的化疗药物有非常显著的优势。

本实验将天花粉蛋白处理人宫颈癌HeLa细胞后，HeLa细胞的生长受到明显抑制。出现凋亡的特征性改变，凝胶电泳呈现典型的梯级格局，而且凋亡细胞的比例随药物浓度的增高及作用时间的延长而增高。这些结果表明天花粉蛋白能抑制HeLa细胞增殖，诱导人宫颈癌HeLa细胞发生凋亡。有关天花粉蛋白诱导HeLa细胞凋亡的具体机制尚在进一步研究之中，天花粉蛋白有良好的应用前景，广大医学研究者共同努力，将其早日应用于临床抗宫颈癌的治疗，为宫颈癌患者的康复带来新的福音。

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