人肾小管上皮细胞necroptosis模型的构建*

蒋 芬， 陈源汉， 梁馨苓△， 李东风， 徐丽霞， 谢红萍， 胡鹏华， 刘双信， 史 伟

(1南华大学附属第一医院肾内科，湖南衡阳421001;广东省人民医院，广东省医学科学院2肾内科，3医学研究中心，广东广州510080)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是指短 时间内肾小球滤过率急剧下降引发的一种常见的临床综合征［1］，严重者甚至危及生命，缺血缺氧及炎症因子是主要病因。肾小管上皮细胞坏死是危重AKI的发生机制［2］。传统的观点认为肾小管上皮细胞坏死是不可以调控的，这一直是制约临床治疗的瓶颈。新近发现了一种可调控的坏死——necroptosis。这种细胞坏死由受体交互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)介导，当给予凋亡阻断剂zVAD-fmk时尤其明显，而使用 necrostatin-1(Nec-1)阻断RIP1可以减少细胞死亡。Necroptosis发生同时会启动细胞自噬，促进微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)由Ⅰ型向Ⅱ型转换。目前认为，LC3-Ⅱ是反映necroptosis发生的标志物。在缺血缺氧模型的心肌细胞、神经细胞以及肿瘤已经发现存在necroptosis［3-5］。但是这一细胞死亡方式在AKI中的作用尚不清楚。研究表明TNF介导的信号通路在necroptosis具有重要作用，因此，为了更好地研究AKI时肾小管上皮细胞necroptosis，本文在TNF-α诱导下同时采用antimycin A耗竭ATP，构建肾小管上皮细胞necroptosis的体外模型，并初步探讨necroptosis在肾小管损伤中的作用。

材料和方法

1 材料

垂直电泳 －转膜装置(Bio-Rad300);酶标仪(Multiskan MK3，Thermo);图像分析仪(Q500IW，Leica);普通光学显微镜(Olympus);低温高速离心机(Beckman);透射电镜(Philips CM10)。肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factorα，TNF-α)、苄氧羰酰-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-氟甲基酮(benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone，zVAD-fmk)和抗霉素A(antimycin A)购自Sigma。Nec-1购于CST。

2 主要方法

2．1 HK-2细胞(ATCC)的体外培养 用含10%胎牛血清的DMEM/F12(Gibco)培养基培养HK-2细胞，待细胞生长至70% ～80%融合时，给予同步化处理24 h后干预。细胞分别给予下列刺激诱导necroptosis:(1)对照组;(2)TNF-α(T 组);(3)TNF-α +zVAD-fmk(TZ组);(4)TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A(TZA组)，在此基础上给予RIP1特异性阻断剂Nec-1。TZ组和TZA组分别设30 min、1 h和2 h时间梯度。

2．2 Necroptosis的诱导和阻断 无血清培养细胞24 h使细胞生长同步化，用10μg/L TNF-α和(或)50μmol/L zVAD-fmK预处理细胞6 h后，加入10 μmol/L antimycin A处理 30 min、1 h和 2 h耗竭ATP。用100μmol/L Nec-1预处理8 h以阻断necroptosis，处理流程见图1。

Figure 1．The processes for the necroptosis model of human renal tubular epithelial HK-2 cells．Nec-1:necrostatin-1;T:TNF-α;Z:zVAD-fmk;A:antimycin A．图1 HK-2细胞necroptosis模型构建处理流程

2．3 细胞形态学检测 将细胞以5×104/L接种于6孔板，经处理后用倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态。

2．4 细胞存活率检测 每组4个复孔，参照CCK-8试剂盒说明书(日本同仁化学研究所)检测细胞存活率:给予对应处理后去除上清液，加入100μL含有10%CCK-8的培养基后继续培养2 h，最后用酶标仪在450 nm波长下检测每孔的吸光度，按公式计算出各孔细胞存活率。细胞存活率(%)=(实验组－空白组)/(对照组－空白组)×100%。

2．5 Western blotting检测LC3-Ⅱ的表达 将6孔板每孔细胞数调整为1×105，裂解细胞后将获得的蛋白按照说明书(兔抗人LC3 B抗体，CST;HRP标记的Ⅱ抗羊抗兔 IgG，Santa Cruz Biotechnology)进行SDS变性蛋白质电泳。

3 统计学处理

采用SPSS 13．0软件分析。计量资料均数±标准差(mean±SD)表示。采用单因素方差分析(Oneway ANOVA)比较各实验组之间差异，方差齐性用LSD法进行组间多重比较，方差不齐用Dunnett’s T3法进行组间多重比较。以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1 相差显微镜下观察HK-2细胞的形态

正常处理组细胞呈卵圆形和不规则形，铺路石状排列于培养瓶底，细胞中央有一卵圆形核。TZA1h组细胞呈现坏死的特征:细胞膜的完整性破坏，细胞和细胞器膨胀，核仁开始裂解，折光性降低，但是在给予Nec-1预处理的TZA1h组细胞坏死的形态学特征明显改善，而Nec-1对正常细胞的形态无明显影响，见图2。

Figure 2．Morphology of HK-2 cells(× 200)．TZA1h:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 1 h图2 不同干预后相差显微镜下细胞的形态变化

2 电镜下HK-2细胞形的态学变化

正常对照组可见HK-2细胞呈椭圆形，胞核完整，细胞膜完整。TZA1h组细胞呈现坏死的特征:细胞膜的完整性破坏，核碎裂，核仁裂解;线粒体开始变圆，嵴消失，并伴随大量双层膜的空泡样物体——自噬小体的出现，见图3。

Figure 3．The morphology of HK-2 cells observed by electron microscopy．TZA1h:TNF-α +zVAD-fmk+antimycin A for 1 h．A:damaged mitochondrium;B:autophagosome．图3 电镜下HK-2细胞的形态变化

3 CCK-8试剂盒检测细胞的存活率

在给予不同处理后细胞的存活率与对照组相比都有不同程度的下降(P＜0．01)，其中以TZA1h和TZA2h下降最为明显，而在给予Nec-1预处理后只有TZA1h组细胞存活率较前增加了38．59%，差异有统计学意义(P ＜0．05)，见图4。

Figure 4．The cell viability of human kidney tubular epithelial HK-2 cells．T:TNF-α;TZ:TNF-α +zVAD-fmk;TZA30 min:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 30 min;TZA1h:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 1 h;TZA2h:TNF-α+zVAD-fmk+antimycin A for 2 h．Mean ±SD．n=4．*P ＜0．05 vs without Nec-1．图4 CCK-8检测HK-2细胞的存活率

4 Western blotting检测细胞LC3-Ⅱ的表达

与正常对照组相比，处理组LC3-Ⅱ的表达都有显著增加(P ＜0．01)，其中 TZ、TZA30min、TZA1h和TZA2h组增加明显，以TZA1h表达量最高(147.67±11．02)，而给予Nec-1处理后只有TZA1h组LC3-Ⅱ的表达量明显下降，下降至89．67±5．03，差异有统计学意义(P ＜0．05)，见图5、6。

讨 论

肾小管上皮细胞的不同死亡方式决定AKI后肾脏的再生修复，是影响预后的关键。细胞死亡包括凋亡和坏死2种类型。前者细胞内容物不外泄，对周围组织损伤轻，而后者的胞内致炎症物质外泄，可导致严重的组织损伤［6］。但是，传统观点认为细胞坏死不可调控，由此推论肾小管细胞坏死无法进行干预。

最近发现，某些细胞坏死也受调控，细胞死亡存在一种介于凋亡和坏死之间的中间类型，并将其命名为necroptosis［3］。这类可调控的细胞坏死由位于细胞膜的RIP1介导［7］。活化RIP1有泛素化和去泛素化2种形式。接受死亡信号后，泛素化RIP1活化caspase-8，启动凋亡;当caspase-8途径受抑制，去泛素化RIP1活化NADPH氧化酶，生成活性氧启动necroptosis。凋亡和necroptosis保持着一定的竞争平衡关系。通常情况凋亡途径占优势;当凋亡途径受抑制时，如使用 caspase抑制剂 zVAD-fmk，necroptosis占优势［8-9］。泛素化RIP1是necroptosis的关键分子，其特异性阻断剂Nec-1可以保护necroptosis［10］。

可调控坏死引起学术界的广泛关注，necroptosis的发现及Nec-1对细胞坏死的特异性阻断作用为临床逆转细胞坏死的可能提供了理论依据［10］。本研究的模型利用了2个原理，一是TNF-α是诱导凋亡和necroptosis共同途径的诱导因子［11-12］，二是采用ATP耗竭的模型模拟了AKI时能量代谢障碍的细胞内条件［13］。我们前期的预实验结果提示，TNF-α刺激下单纯采用zVAD-fmk干预不足以诱导necroptosis。而在用antimycin A耗竭鼠肾小管上皮细胞ATP的模型中，ATP耗竭的程度可决定细胞死亡方式，ATP轻度耗竭时细胞凋亡，而ATP严重缺乏时肾小管上皮细胞发生坏死［12］。因此我们加用antimycin A耗竭ATP(TZA组)来加强对肾小管上皮细胞的损伤作用，结果表明TZA刺激能够诱导细胞坏死，而且这种坏死同时启动了自噬及LC3-Ⅱ转换，Nec-1能抑制这种细胞坏死，这些特点均符合necroptosis的生物学特征。这一模型的建立为进一步开展肾小管上皮细胞necroptosis的体外研究提供了工具和基础。

Figure 5．Western blotting analysis for the LC3-Ⅱprotein expression．图5 Western blotting检测LC3-Ⅱ蛋白的表达

Figure 6．The expression of LC3-Ⅱin tubular epithelial cells detected by Western blotting．Mean±SD．n=3．*P ＜0．05 vs without Nec-1．图6 HK-2细胞不同组LC3-Ⅱ表达量的变化