HPLC测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量

马 力，杨丽梅，徐倩倩，郭时金，沈志强*，柳增善

( 1.吉林大学 畜牧兽医学院,吉林 长春 130062;2.山东省滨州畜牧兽医研究院,山东 滨州 256600 )

银黄制剂是指由金银花提取物和黄芩提取物制备而成的中药制剂，主要有银黄口服液、银黄注射液和银黄颗粒剂；兽用银黄制剂主要有银黄口服液和银黄注射液。银黄颗粒系根据其口服液改型而成，是由绿原酸和黄芩提取物制成的复方制剂,具有清热疏风,利咽解毒,抗菌消炎之功效[1]，兽医临床上主要用于治疗和预防鸡传染性喉气管炎、传染性支气管炎所致的肺热咳喘等疾病，是目前用于预防禽流感的六大药物之一，临床上被广泛应用。为严格控制产品质量,保证药物预防和治疗疾病的效果，本研究建立了一套运用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatographg,HPLC)法测定银黄颗粒中的有效成分绿原酸、黄芩苷含量的测定方法,并从标准曲线、精密度、稳定性、重复性、回收率等方面对该方法进行了方法学考证。通过对试验数据科学的分析观察,该法具有测定方法简便、数据准确性好和重现性好的特点，可以实现对银黄颗粒质量的有效控制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent1260系列高效液相色谱仪;G1329B自动进样器、G1314F可变波长检测器、Agilent Chemstation色谱工作站);千万分之一电子天平(梅特勒);SB3200型超声波清洗器(上海新芝生物技术研究所);Millipore超纯水系统。乙腈、甲醇(色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)、磷酸(分析纯，烟台市双双化工厂)。绿原酸对照品(购自中国药品生物制品检定所,批号为110753-201117,含量为96.60%，用于含量检测)、黄芩苷对照品(购自中国药品生物制品检定所,批号为110715-201105,含量为94.00%，用于含量测定)、银黄颗粒制剂(本公司实验室自制)。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件与系统试用性试验 色谱柱:十八烷基硅烷基键合硅胶柱4.6 mm×250 mm;流动相:乙腈-0.4%磷酸溶液(10∶90)和甲醇-水-0.2%磷酸(50∶50∶0.2);绿原酸检测波长为327 nm；黄芩苷检测波长为274 nm;流速:1.00 mL/min，柱温:30℃。在此条件下，理论塔板数按绿原酸峰计为8 000,按黄芩苷峰计为6 000。绿原酸和黄芩苷色谱峰与其他杂质峰分离度大于1.5。结果显示，在上述波长下样品色谱峰分离度很好，并且阴性供试品溶液对绿原酸和黄芩苷的测定无干扰。

1.2.2 溶液制备

1.2.2.1 对照品溶液的制备

(1)绿原酸对照品储备液的制备。精密称取60 ℃减压干燥至恒重的绿原酸对照品8.40 mg,置于10 mL棕色量瓶中,加入适量50%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,备用[3]。精密量取对照品储备液1 mL,置10 mL棕色量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得含绿原酸对照品0.084 mg/mL溶液。

(2)黄芩苷对照品。精密秤取105 ℃干燥至恒温的黄芩苷对照品6.5 mg,加入25 mL量瓶中并用适量50%甲醇溶解并稀释至25 mL,摇匀,即得黄芩苷对照品0.260 mg/mL溶液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 取银黄颗粒0.2 g, 精密称定，用研钵研细,置具塞三角瓶中,精密加50%的甲醇50 mL,称重，超声提取15 min,放置室温后放冷，再称量后用50%甲醇补足减失的质量,摇匀，过滤，取续滤液备用[4]。精密移取1 mL置于10 mL量瓶中加50%甲醇至刻度，混匀，作为供试品溶液。按上述方法制备不含绿原酸和黄芩苷的阴性样品溶液。

1.3 专属性考察

分别制备不含金银花提取物阴性对照品和不含黄芩提取物阴性对照品溶液,依法进样测定[5]。考察本文确定的测定条件下,绿原酸和黄芩苷的测定是否受干扰。

1.4 线性关系的考察

精密吸取绿原酸对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，黄芩苷对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,在上述色谱条件下分别进样并记录峰面积,以对照品进样量(μg)为横坐标，相应的峰面积为纵坐标,进行线性回归。

1.5 精密度试验

按上述色谱条件,取绿原酸和黄芩苷对照品溶液分别进样6次,测得峰面积积分值进行计算绿原酸的RSD。

1.6 稳定性试验

取同一批(20121023)样品，按1.2.2制备方法分别制备5份，分别于1,3,6,12,24 h进样测定,每次进样10 μL[6]。测定峰面积值,绿原酸峰面积积分值RSD。

1.7 重现性试验

取同一批(批号:20121023)样品，按1.2.2制备方法分别制备6份供试品，按上述色谱条件测定。测定峰面积值,绿原酸和黄芩苷峰面积积分值RSD。

钙硫比的增加对所获得的粉煤灰脱硫活性起到促进作用，但CaCO3的增加必然对炉内煤粉燃烧特性产生影响，若其加入严重影响煤粉燃烧特性，那么对上述研究就失去了意义。为此，笔者进一步针对钙硫比对煤粉燃烧特性的影响进行研究。

1.8 回收率试验

1.8.1 绿原酸回收率试验 精密秤取同一批(批号20121023)的样品5份,加入量瓶中,分别精密加入一定量的绿原酸对照品储备溶液,按供试品溶液制备方法制备并测定[7],计算回收率。

1.8.2 黄芩苷回收率试验 精密秤取同一批(批号20121023)的样品细粉5份,加入量瓶中,分别精密加入一定量的黄芩苷对照品储备溶液,按供试品溶液制备方法制备并进行测定,计算回收率。

1.9 样品含量测定

对照1.2.2项下的方法制备供试品溶液,依法进样测定,共分析三批样品。计算样品中绿原酸和黄芩苷的含量。

2 结果与分析

2.1 专属性考察

绿原酸对照品、供试样品色谱图、不含有金银花提取物色谱图及黄芩苷对照品、供试样品色谱图、不含有黄芩提取物色谱图分别见图1-6。表明在本研究确定的测定条件下,绿原酸和黄芩苷的测定不受干扰。

图1 绿原酸对照品色谱图Fig.1 Chromatogram of Chlorogenic acid

图2 供试品色谱图Fig.2 Chromatogram of the test sample

2.2 线性关系考察

绿原酸的回归方程为Y=15343.5X-235.42，r=0.9997(n=6)，在0.336～3.36 μg/mL内有良好的线性关系； 黄芩苷的回归方程为Y=28541.9X-85.243，r=0.9996(n=6)，在0.130～130 μg/mL有良好的线性关系。

2.3 精密度试验结果

按上述色谱条件,取绿原酸和黄芩苷对照品溶液分别进样6次,测得峰面积积分值进行计算绿原酸的RSD=1.12%(n=6)。黄芩苷的RSD=1.01%(n=6)，结果表明该测定方法具有良好的精密度。

图3 阴性样品(不含金银花提取物)色谱图Fig.3 Chromatogram of the negative control(omit Lonicera japonica extract)

图4 黄芩苷对照品色谱图Fig.4 Chromatogram of baicalin

图5 供试品色谱图Fig.5 Chromatogram of the test sample

图6 阴性样品(缺黄芩提取物)色谱图Fig.6 Chromatogram of the negative control (omit scutellaria extract)

2.4 稳定性试验结果

2.5 重现性试验结果

绿原酸的含量RSD=1.15%(n=6),黄芩苷的含

量RSD=0.43%(n=6),表明该方法重现性良好。

2.6 回收率试验结果

2.6.1 绿原酸回收率 样品中绿原酸回收率结果见表1。

2.6.2 黄芩苷回收率 样品中黄芩苷回收率见表2。

2.7 样品含量测定结果

三批样品中绿原酸和黄芩苷测定结果见表3。

表1 绿原酸回收率试验结果(n=5)Table 1 The results of recovery rate of Chlorogenic acid (n=5)

表2 黄芩苷回收率试验结果(n=5)Table 2 The results of recovery rate of baicalin (n=5)

表3 三批样品含量的测定结果 Table 3 Contents of chlorogenic acid and Baicalin in three batches of samples

3 讨 论

高效液相色谱法测定银黄颗粒剂中绿原酸,之前曾筛选过乙腈-0.4%磷酸(30∶70),(20∶80),后将比例调至(10∶90)分离效果较好;之前曾筛选过甲醇-水-0.1%磷酸(50∶50:0.4),甲醇-水(1∶1),甲醇-水-0.4%(50∶50∶0.4),结果均不理想,最后采用甲醇-水-0.2%磷酸(50∶50∶0.2)分离效果较好，并能获得很好的柱效，峰形和分离度都很好[8]。

应用HPLC法对银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量进行测定,经方法学研究表明此方法简便易行,准确度高,精密度、灵敏度等指标符合要求。可作为银黄颗粒的质量标准的检测方法提供可靠的参考依据，并能确保产品质量。

在试验过程中发现，绿原酸对照品溶液稳定性较差，放置时间过长，会产生部分有效成分分解，影响样品含量检验的准确度，因此在配制绿原酸对照品时，采用棕色量瓶，提高绿原酸对照品溶液的稳定性，保证测定样品含量的准确度。

4 结 论

本研究中建立的HPLC法具有样品处理简便、色谱分离度、重现性好的特点，可用于银黄颗粒制剂质量的控制。

参考文献:

[1] 李宇清，刘劲松.HPLC测定银黄颗粒剂中绿原酸和黄芩苷的含量[J].现代中药研究与实践，2004,18(5)：45-47.

[2] 赵秀香，李启艳，王 磊.HPLC法测定银黄注射液中绿原酸的含量[J].药物分析杂志,2006,26(12):1 880-1 882.

[3] 胡春湘,陈忠梁,张正光.HPLC测定银黄片中绿原酸和黄芩苷的含量[J].中成药杂志,2003,25(5):418.

[4] 林 敏.RP-HPLC法同时测定双黄连胶囊中的绿原酸及黄芩苷的含量[J].海峡药学,2006,18(4):78-79.

[5] 张冬梅，桑 媛，刘 冰.HPLC法同时测定双黄连注射液中绿原酸及黄芩苷含量[J].药物分析杂志，2005,25(10)：1 279-1 280.

[6] 石连成,王月华.HPLC法测定金银花中绿原酸的含量[J].黑龙江医药,2002，15(2):92.

[7] 袁 浩，刘永利，李冬梅.HPLC法测定银黄片中绿原酸与黄芩苷含量[J].中国民族民间医药，2010，10(17)：61-62.

[8] 钟英杰，李 亮，徐福亮. HPLC法同时测定银黄颗粒中绿原酸和黄芩苷含量的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2010(8)：104-105.