PRV、PCV-2、PRRSV与HPs混合感染的核酸检测

才让卓玛,宋秀红

(青海省海西州德令哈市畜牧兽医工作站 , 青海 德令哈 817000)

近年来，随着我国养猪业的规模化、现代化、集约化发展，猪群的疫病感染情况日趋复杂，呈现出多病原的混合感染或继发感染[1]。混合感染包括病毒与病毒的混合感染、细菌与细菌的混合感染以及病毒与细菌的混合感染[1-2]。混合感染常常导致猪群的发病率和死亡率增高，控制难度增加，危害日趋严重[2-3]。在猪场发生的病毒性疫病中，以猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type，PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、猪瘟病毒Classical Swine Fever virus，CSFV)等4种病毒的感染较为多见，是引起猪繁殖障碍性疫病的主要病原，且PRV、PCV-2、PRRSV、PPV、CSFV等病毒感染后，会损伤机体的免疫系统，引起免疫缺陷，降低机体对外界环境的抵抗力，常常引起继发感染[4-6]。副猪嗜血杆(Haemophilus parasuis，HPs)可以引起猪的格氏病(Glasser's disease)，严重危害仔猪和青年猪的健康，在全球范围影响着养猪业的健康发展[7-8]。HPs多由病毒感染而继发，现已报道的有PRRSV和PCV-2继发HPs感染[9]，PRV与猪乙型脑炎病毒(JEV)继发HPs感染[10]，PRRSV继发HPs和大肠杆菌混合感染[11]等。本研究对青海省某规模化发病猪场进行临床诊断后，初步认为该猪场由PRRSV与PCV-2 2种病毒性疾病继发HPs的混合感染所致，为进一步确诊，本研究结合猪场疫苗的免疫背景，对采集的临床具有典型病变特征的组织病料进行了常见病毒与细菌共计13种病原体核酸的分子生物学检测与序列鉴定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 临床诊断与病料的采集

2012年10月青海省某规模化猪场保育猪暴发了一起以消瘦、体温升高、两耳及后躯等部位发绀、站立不稳、后躯无力、个别出现呕吐及腹泻物水样、全身脏器出血或淤血、肿大等为主要临床特征的传染病，经流行病学调查、临床诊断、病理剖检初步诊断为猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒与副猪嗜血杆菌混合感染。无菌采集病死猪的肝脏、脾脏、淋巴结等病变组织，作为临床组织病料样品，低温保存和运输。

1.2 载体与菌株

pMD18-T克隆载体、大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 试剂及试剂盒

M-MLV反转录酶、dNTP、Taq酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒、病毒基因组RNA提取试剂盒、病毒基因组DNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自北京三博远志生物技术有限责任公司。

1.4 引物的设计与合成

分别根据参考文献[1]、参考文献[2]、参考文献[12]设计针对猪链球菌(SS)cps2J基因、猪巴氏杆菌(PM)16SrRNA基因、副猪嗜血杆菌(HPS)16SrRNA基因、胸膜肺炎放线杆菌(APP)omlA基因、猪支原体(Mhp) P46基因、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2基因、猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF7基因、猪细小病毒(PPV)NS1基因、猪瘟病毒(CSFV)E2基因、猪乙型脑炎病毒(JEV)E基因、猪流行性腹泻病毒(PEDV)M基因、猪轮状病毒(RV )VP7基因、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)N基因的特异性检测引物，引物序列如表1所示，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence table

1.5 病料样品的处理与基因组的提取

将现场采集的临床组织病料与4倍体积的灭菌生理盐水充分混合、捣碎、碾磨，反复冻融3次，离心，将上清液分成3份，分别按细菌基因组DNA提取试剂盒、病毒RNA提取试剂盒、病毒DNA提取试剂盒的操作步骤分别提取临床组织病料的细菌基因组DNA、病毒基因组RNA、病毒基因组DNA。

1.6 RNA病毒的cDNA合成

以提取的组织病料的基因组RNA为模板，分别进行PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV cDNA的合成。反转录总体系为20 μL，含5×M-MLV Buffer 4 μL、dNTP 2 μL、下游引物P2(PRRSV或CSFV或JEV或PEDV或TGEV)0.5 μL、RNA 5 μL、M-MLV 0.5 μL、dd H2O 8 μL。反转录条件为：42 ℃水浴1h，70 ℃ 水浴10 min，冰浴。

1.7 PCR扩增反应

以提取的细菌基因组DNA为模板，进行SS、PM、HPS、APP、Mhp的PCR扩增；以提取的病毒基因组DNA为模板，进行PCV-2、PRV、PPV的PCR扩增；分别以反转录合成的PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV 的cDNA为模板，进行PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV的PCR扩增。PCR扩增体系均为25 μL，含10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、上游引物P1(分别为SS、PM、Mhp、APP、HPS、PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV)0.5 μL、下游引物P2(分别为SS、PM、HPS、APP、Mhp、PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV)0.5 μL、Taq 酶0.5 μL、DNA(或cDNA)5 μL、dd H2O 14 μL。PCR扩增参数为：95 ℃ 预变性5 min；94 ℃变性45 s，退火 45 s(SS 54 ℃、PM 56.5 ℃、HPS 60 ℃、APP 60 ℃、Mhp 52 ℃、PCV-2 57 ℃、PRV 60 ℃、PPV 53 ℃、PRRSV 57 ℃、CSFV 56 ℃、JEV 58 ℃、PEDV 55 ℃、TGEV 55 ℃)，72 ℃ 延伸45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.8 PCR扩增反应的序列鉴定

PCR扩增产物先经琼脂糖凝胶电泳进行扩增片段大小的初步检测，将与预期大小相符的PCR扩增产物用DNA胶回收试剂盒进行回收纯化，将其连接至pMD18-T克隆载体，转化DH5α菌株感受态细胞，提取质粒DNA，经PCR鉴定得到阳性克隆质粒，将其送北京三博远志生物技术有限责任公司进行序列测定，将测序结果应用blast在线软件与GenBank中登录的序列进行比较与分析。

1.9 重复性检测试验

采集猪场不同病死猪的具有典型症状的组织病料3份，分别按以上方法进行检测，判定检测结果是否一致。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

分别以提取的细菌基因组DNA、病毒基因组DNA、以及合成的PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV 的cDNA为模板，分别选用SS、PM、HPS、APP、Mhp、PCV-2、PRV、PPV、PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV的特异性检测进行PCR扩增。结果如图1所示，HPS、PCV-2、PRV、PRRSV引物的PCR扩增产物分别在822 bp、353 bp、178 bp、433 bp处可见特异性扩增条带，均与预期的扩增片段大小相符。

图1 病料PCR扩增结果Fig.1 Result of PCR amplification M.DNA标准DL 2000; 1.SS; 2.PM;3.HPS;4.APP;5.Mhp;6.PCV-2;7.PRV;8.PPV;9.PRRSV;10.CSFV;11.JEV;12.PEDV;13.TGEV M.DNA Marker DL 2000; 1.SS; 2.PM;3.HPS;4.APP;5.Mhp;6.PCV-2;7.PRV;8.PPV;9.PRRSV;10.CSFV;11.JEV;12.PEDV;13.TGEV

2.2 PCR扩增反应的序列鉴定结果

分别将HPS、PCV-2、PRV、PRRSV引物的PCR扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化后，连接至pMD18-T载体，经PCR鉴定分别得到了阳性克隆质粒pMD18-HPS、pMD18-PCV-2、pMD18-PRV、pMD18-PRRSV(如图2所示)。测序公司对阳性克隆质粒pMD18-HPS、pMD18-PCV-2、pMD18-PRV、pMD18-PRRSV的测序结果显示，所插入T载体中的特异性序列分别为HPS 16SrRNA基因、PCV-2 ORF2基因、PRV gE基因、PRRSV ORF7基因特异性核苷酸序列。

2.3 重复性检测试验结果

采集不同病死猪的3份具有典型症状的组织病料，其检测结果完全一致，说明该猪场确实存在PRV、PCV-2、PRRSV与HPs的混合感染，同时也表明本检验方法具有良好的稳定性和准确性。

图2 克隆载体的PCR鉴定Fig.2 Identification of cloning vector M.DNA标准DL 2000;1.HPS;2.PCV-2;3.PRV;4.PRRSV M.DNA Marker DL 2000;1.HPS;2.PCV-2;3.PRV;4.PRRSV

3 讨 论

近年来，猪病毒性疾病在我国不断爆发，已成为影响我国现代养猪业健康快速发展的主要动物疫病，且多呈混合感染形式存在，并常常继发副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌等细菌感染，给临床病原学的确诊增加了难度，带来了困难。而分子生物学诊断技术的迅速发展，给疫病的快速确诊开辟了新的视野。PCR方法作为最简单、最适用的分子生物学诊断方法，具有灵敏度高、特异性强、速度快、重复性好等优点，且能够检测病原体中特异的核苷酸序列，具有常规诊断方法无法比拟的准确性。本病例就是在临床诊断初步怀疑为PCV-2、PRRSV与HPs混合感染的基础上，进行了其余10种病原体的PCR检测，结果表明该病例中还存在PRV感染，弥补了临床诊断的局限性。为避免单一病例的特殊性，造成漏检，本研究选取了不同病死猪的3份病料进行了重复性检测，检测结果完全一致。同时为避免PCR诊断方法存在假阳性的结果，本研究对PCR扩增为阳性的4种病原体的扩增产物全部进行了克隆和序列测定，鉴定结果表明所得到的PCR扩增产物均为4种病原体的特异性核苷酸序列，表现出了极高的准确性。对于该猪场的致病原因，确定为由PRV、PCV-2、PRRSV混合感染，导致机体免疫缺陷，引发HPs的继发感染。对于该种混合感染性疫病，目前尚无十分有效的治疗方法，猪场应加强饲养管理，遵循“防重于治”的原则，制定合理的免疫程序，确实做好猪群的疫苗免疫接种工作。

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