动物机体热休克应答相关信号途径的研究进展*

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(1.中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193；2.沈阳农业大学 畜牧兽医学院，辽宁 沈阳 110866)

机体受到高温、缺氧及氧化等刺激会产生全身性应答反应，包括机体体温及激素等变化，同时产生以基因表达为主的细胞应答反应。动物处在不良的饲养、运输、屠宰等环境中，会产生热应激。热应激能够影响动物机体的生产性能、代谢机能以及免疫性能，同时会激活机体细胞内的信号途径，改变机体内基因表达。目前热应激的研究中，较多针对的是热应激引起机体表观性能的变化，而热应激对细胞内在应答以及对信号途径的调控仍不明确，因此本文就热应激引起机体内信号途径的变化作一综述。

1 热休克应答与热休克蛋白的产生

当细胞受到热应激后，细胞膜的生理状态紊乱，膜内脂类显著下降并在短时间内不能形成磷脂双分子层结构，此外，细胞膜脂类-蛋白的相互作用也受到影响[1]。热应激增加膜的流动性，抑制Ca2+转运系统如钙泵(Ca2+-ATP激酶)和Na+/Ca2+交换器中Ca2+的转运，诱发胞质中Ca2+浓度增加[2]。热应激也导致细胞质以及亚细胞器发生变化，如线粒体损伤，诱发活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生[3]。机体对热应激产生的反应，称为热休克应答(heat shock response，HSR)，HSR诱导分子伴侣、蛋白酶和维持细胞内稳态蛋白质的基因编码，用于抵抗应激产生的损伤。HSR的最大特点是诱导热休克因子(heat shock factor，HSF)磷酸化产生高度保守的热休克蛋白(heat shock protein，HSP)[4]。

HSF1是大多数热休克家族蛋白如HSP70和HSP90的启动子。在正常条件下，HSF1与调控蛋白如HSP70和HSP90在胞液中形成杂合物，使HSF1处于抑制状态。当机体受到热应激后，HSF1通过非激活单体向三聚体的转变、向核的易位、与热应激原件结合等步骤完成激活，成为激活热休克基因和靶基因上游的共识序列，从而激活HSP基因转录，产生HSP[5-6]。

HSP是机体受到应激时产生的特异性指标，在正常情况下机体内HSP含量较少，机体遭受应激后HSP含量显著升高[7]。HSP按分子量大小分为以下几个家族：HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP和泛素等，其中最重要的是HSP70家族[8]。HSP70是细胞的主要伴侣分子，指导蛋白质折叠和易位。HSP也参与细胞周期调控、细胞凋亡以及抗氧化防御等过程。研究显示，HSR引发HSF与HSP的改变，这一过程通过细胞内ROS和Ca2+调控多条信号通路的变化来实现。

多位学者研究发现热应激能够产生ROS[9-10]，ROS是一类有高度化学反应活性的含氧基团，是细胞氧化磷酸化过程中氧的代谢副产物，包括羟自由基、超氧阴离子、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化自由基等[11]。正常的生理条件下，动物机体内产生ROS，同时机体防御系统清除ROS，使体内的ROS处于动态平衡状态。当机体受到应激后，细胞线粒体损伤产生过量的ROS，这些防御系统不足以清除ROS至平衡状态，导致机体处于氧化应激状态[12]。ROS为应激过程中的关键因子，主要调控丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、丝苏氨酸蛋白激酶(serine threonine kinase，Akt)等来完成HSR。

Ca2+是细胞内的关键离子，在正常生理状态下，细胞有一套完善的体系来维持钙的稳态平衡，细胞内Ca2+浓度极低(10-7mol/L)，细胞外Ca2+浓度较高(10-3mol/L)，当受到热应激时，细胞膜流动性增加[13]，热应激改变Na+/Ca2+交换器并激活机械敏感性离子通道以及瞬时感受器电位(TRP)通道，改变Ca2+的平衡，引起细胞内Ca2+浓度增加。Ca2+可以直接激活钙调素依赖性蛋白激酶II(calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)，参与HSF的转录，也可以通过调控二酰甘油(diacylglycerol，DAG)、磷脂酶C(phospholipase C，PLC)的活性及蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的磷酸化诱导HSF磷酸化，引起HSR见图1。

2 热休克应答相关信号途径

2.1 Ras超家族

Ras超家族是一类受细胞膜约束的GTP连接蛋白，具有高度保守的GTP结合结构域，根据序列结构和细胞功能被分为七个家族：Sar1、Arf、SRβ、Ran、Rab、Rho和Ras。Ras超家族在多种细胞生理功能上起重要作用，包括细胞周期、细胞分化、调控细胞的形态和运动以及细胞内分子的转运等功能[14]。Ras超家族有“继电器”的功能，调控其上游细胞质的信号级联反应以及下游细胞表面的受体酪氨酸激酶的活性。Ras超家族的生理功能受多种信号途径调控，包括Raf-ERK1/2信号途径，PI3K-Akt信号途径以及Rho-Rac1-NADPH信号途径[15]。

热应激(39 ℃-42 ℃，15 min)激活Ras超家族信号途径的主要组分-Ras和Rac1，热应激诱导细胞膜的流动也是依赖于Rac1信号途径完成的。热应激可能通过影响膜的结构和流动性，激活多种生长因子受体，这些生长因子激活Ras信号途径，另外，Ras信号途径也可能直接被热应激激活[16]。热应激时，Rac1N17(Rac1基因的显性负效突变体)过表达时会造成Rac1的显性突变，能够阻止HSF1的激活以及HSP的表达[17]，这种情况也发生在低氧应激、重金属应激以及机械应激中，这意味着Rac1蛋白在应激诱导的HSF1的激活和HSP70的表达中起重要作用[18-19]。

图1 热应激调控HSP基因表达相关信号途径Fig.1 Heat stress regulates signaling pathways related to HSP gene expression

2.2 MAPK信号途径

MAPK途径包含大量的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节各种细胞过程，包括细胞增殖、分化、应激适应和细胞凋亡。活化前的MAPK存在于胞浆内，活化后即进入核内激活靶基因。MAPK通路的上游因子为MAPK级联激酶(MAPKK，包括MEK1/2等)和MAPK级联激酶磷酸化激酶(MAPKKK，包括Raf蛋白等)。MAPK通路信号途径是通过MAPKKK、MAPKK和MAPK连续的磷酸化作用实现的[20]。热应激影响膜的稳定性，激活表皮生长因子受体酪氨酸激酶，从而激活Ras蛋白，Ras蛋白进一步激活MAPKKK如Raf蛋白，完成一系列的磷酸化作用，最终激活MAPK[21]。

MAPK激酶基于结构上的差异，分为三个亚家族：细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，氨基末端激酶/应激活化蛋白激酶(Jun N-Terminal Kinase/stress-activatived protein kinase，JNK/SAPK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p 38 mitogen activated protein kinase，p38MAPK)。Michael等[22]研究证实，ERK途径与细胞增殖有关，JNK和p38MAPK与应激有关。最近研究显示在细胞应对热应激时，ERK、JNK、p38MAPK都在HSR中起重要作用。

2.2.1 ERK信号途径 Lin等[21]对NIH3T3成纤维细胞进行瞬时(5 min)热应激(43 ℃)可以通过磷酸化ERK的Thr202/Tyr204位点激活ERK，这一效应可以通过显性失活的Raf突变抑制。有研究显示，在氧化应激、重金属应激等条件下，ERK信号途径也能够通过作用于HSF1的磷酸化诱导HSP70的表达，而抑制ERK信号途径则减少HSP70的表达[23-24]。在热应激条件下，Jill等[25]对斑马鱼细胞进行热应激(40 ℃)5 min～60 min，能增加ERK的磷酸化活性，并在热应激30 min时有显著的上升(P<0.05)，同时诱导HSP70的表达，当使用ERK的特异性抑制剂PD98059和U0126作用于热应激细胞时，会显著降低HSP70的表达(P<0.05)，证明ERK信号途径与HSR密切相关。然而，Sahin等[26]对鹌鹑进行每天8 h的热应激(34 ℃)，持续12周发现，热应激能够降低ERK活性。

2.2.2 JNK/SAPK信号途径 在大鼠的肝脏细胞，热应激激活JNK/SAPK信号途径、p38MAPK信号途径以及上游激酶MKK3/6和PAK，但不能影响谷胱甘肽S-转移酶的活性[27]。在MA-10细胞中，进行10 min热应激(45 ℃)能够快速激活ERK和JNK的活性[28]。对紫贻贝(一种贝类)进行热应激后，能够调控JNK和p38MAPK的磷酸化(P<0.01)，并诱导HSP70的上调[29]。

2.2.3 p38MAPK信号途径 Banerjee等[30]证实，在肺部成纤维细胞中，热应激产生ROS，ROS进一步调控激活p38MAPK，p38MAPK激活Akt信号途径从而导致HSP70的产生。添加乙酰半胱氨酸(抗氧化剂)阻止p38MAPK磷酸化和HSP70的增加。添加SB203580(p38MAPK的特异性抑制剂)显著抑制p38MAPK磷酸化(减少了80%磷酸化)，抑制HSF1的转录活性和核易位，并且减少了HSP70的表达(减少了近70%表达量)。Han等[31]发现热应激诱导p38MAPK在Thr180位点和Tyr182位点磷酸化。此外，p38MAPK在有丝分裂间期可受低剂量的氧化应激激活[32]。

2.3 PI3K-Akt信号途径

PI3K参与细胞的生长、凋亡、细胞骨架的重组、代谢控制等过程，是细胞内重要的调控蛋白之一，PI3K是特异性催化磷脂酰肌醇(PI)的激酶，是细胞内重要的信号转导分子，PI3K活化产生PIP2和PIP3，这两种类脂产物可作为第二信使发挥信号级联作用。PI3K根据催化亚基和作用底物分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型PI3K[33]。受体酪氨酸激酶、Gβγ二聚体以及Ras超家族均能激活PI3K，PI3K具有双重酶活性即脂类激酶和蛋白激酶的活性[34-35]。PI3K通常与Akt(也称为蛋白激酶B，protein kinase B)联合发挥作用，Akt是PI3K的主要下游靶蛋白，包括Akt1，Akt2，Akt3三种亚型。PI3K通过催化PIP2向PIP3的转化、PIP3与Akt结合、磷酸肌醇依赖蛋白激酶1(Phosphoinositide dependent protein kinase 1，PDK1)与Akt的相互作用三个步骤完成对Akt的激活[36]。

热应激磷酸化Akt的Ser9位点，从而激活其下游途径GSK3β。LY294002为PI3K的抑制剂，能特异性阻止Akt的磷酸化，由此可见热应激是通过PI3K激活Akt信号途径的。热应激诱导的PI3K-Akt激活可能与凋亡抑制相关[28]。对大鼠进行热应激(41 ℃)30 min后能够提高Akt与mTOR的磷酸化水平(P<0.05)，从而增加蛋白质合成[37]。对心肌细胞进行热应激(42 ℃)20 min后能够显著增加Akt的磷酸化水平(P<0.05)[38]。用水浴的方法对大鼠进行热应激(42 ℃)后能够显著激活Akt的活性(P<0.05)，显著提高HSP70的表达量(P<0.05)[39]。

2.4 PKC信号途径

PKC是一类依赖于DAG以及Ca2+的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是重要的信息传导蛋白，介导生物信号从细胞膜向细胞核的传递，构成细胞内重要的信号转导系统，对细胞分化、增殖和凋亡起重要调节作用[40]。

PKC通常以无活性的形式存在于细胞中，当细胞受到热应激后，胞内PIP2和PIP水平下降，激活PLC，使膜磷脂分解，产生三磷酸肌醇(IP3)和DAG，IP3是Ca2+动员信使，促使Ca2+池中的Ca2+释放，胞浆中Ca2+升高，从而激活PKC，而DAG可直接激活PKC，PKC被激活后，由胞浆转向胞膜[41]。此外，PKC与MAPK之间存在相互联系，PKC可激活MAPK上游激酶，引起MAPK的级联磷酸化反应。

多种研究显示PKC参与应激应答，并产生HSP。紧张应激能够诱导PKC磷酸化，增加HSP70的表达，使用PKC抑制剂会抑制HSP70表达。对小鼠成纤维细胞进行热应激(41 ℃～45 ℃)30 min后，PKC活性增强，使用PKC抑制剂chelerthrine chloride能显著降低PCK活性，并抑制HSP70的表达(P<0.01)，使用PKC激动剂PMA能提高PKC活性并促进HSP的表达(P<0.01)。

3 小 结

综上所述，热应激能够引起机体细胞内ROS和Ca2+的产生，通过激活Ras超家族、MAPK、PI3K/Akt、PKC信号途径完成HSR，产生HSP。关于热应激引起的ROS和Ca2+的改变，其二者是否存在内在的联系还需要进一步验证，ROS对于各个信号途径的作用靶点也需要进一步证实，热应激对于信号途径的激活或抑制还存在一定争论，这可能是由于不同机体对于热应激敏感程度不同导致的。热应激对于动物生产性能以及动物生理心理状态都产生不利的影响，深入研究热应激对动物机体的调控作用，并找出缓解动物的热应激的方法，对动物生产、动物福利具有重要的意义。

参考文献：

[1] Epand R M. Lipid polymorphism and protein-lipid interaction[J]. Biochim Biophys Acta, 1998,1376:353-368.

[2] Bromberg Z,Goloubinoff P, Saidi Y, et al. The membrane-associated transient receptor potential vanilloid channel is the central heat shock receptor controlling the cellular heat shock response in epithelial cells[J].PLoS One, 2013,8(2):e57149.

[3] Waring P. Redox active calcium ion channels and cell death[J]. Arch Biochem Biophys, 2005,434:33-42.

[4] Welch W J, Kang H S, Beckmann R P, et al. Response of mammalian cells to metabolic stress: changes in cell physiology and structure function of stress proteins[J].Curr Top Microbiol Immunol, 1991,167:31-55.

[5] Morimoto R I. Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors molecular chaperones and negative regulators[J]. Genes Dev, 1998,12:3 788-3 796.

[6] Pirkkala L, Nykanen P, Sistonen L. Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond[J]. FASEB J, 2001,15:1 118-1 131.

[7] 任宝波,王玉艳,王纯净,等.HSP70家族的分类及基因结构与功能[J].动物医学进展,2005,26(1):98-101.

[8] 邬堂春,贺涵贞,张国高.热休克蛋白研究的进展与前景[J].中华预防医学杂志,2000,30(2):65-66.

[9] Khar A, Kumari A L, Pardhasaradhi B W, et al. Heat stress induced apoptosis in BC-8 cells derived from AK-5 tumor involves downregulation of Bcl-2 and generation of reactive oxygen species[J]. Indian J Exp Biol, 2006,44(10):802-808.

[10] Del Vesco A P,Gasparino E. Production of reactive oxygen species gene expression, and enzymatic activity in quail subjected to acute heat stress[J]. J Anim Sci, 2013,91(2):582-587.

[11] 王丙云,赵海全,冯 军,等.不同毒力鸭肝炎病毒对雏鸭肝脏抗氧化功能的影晌[J].中国兽医学报,2002,22(5):450-452.

[12] Finkel T, Holbrook N J. Oxidants oxidative stress and the biology of aging[J]. Nature, 2000,408:239-247.

[13] Kültz D. Molecular and evolutionary basis of the cellular stress response[J]. Annu Rev Physiol, 2005,67:225-257.

[14] 张 岩,黄文秀,吴春福.Ras依赖型的MAPK细胞内信号转导通路[J].医学综述,2007,13(3):189-191.

[15] Bar-Sagi D,Hall A. Ras and Rho GTPases: a family reunion[J]. Cell, 2000,103:227-238.

[16] Rudolph M G,Linnemann T, Grunewald P, et al. Thermodynamics of Ras effector and Cdc42 effector interactions probed by iso-thermal titration calorimetry[J]. J Biol Chem, 2001,276:23 914-23 921.

[17] Han S I, Oh S Y, Woo S H, et al. Implication of a small GTPase Rac1 in the activation of c-jun N-terminal kinase and heat shock factor in response of heat shock[J]. J Biol Chem,2001,276:1 889-1 895.

[18] Ozaki M, Deshpande S S,Angkeow P, et al. Rac1 regulates stress-induced, redox-dependent heat shock factor activation[J]. J Biol Chem, 2000,275:35 377-35 383.

[19] Xu Q, Schett G, Li C, et al. Mechanical stress-induced heat shock protein 70 expression in vascular smooth muscle cells is regulated by Rac and Ras small G proteins but not mitogen-activated protein kinases[J]. Circulation Res, 2000,86:1 122-1 128.

[20] YOSHIOKA K. Scaffold Proteins in Mammalian MAP Kinase Cascades[J]. J Nutr Biochem, 2004,135(6):657-661.

[21] Lin R Z, Hu Z W, Chin J H, et al. Heat shock activates c-Src tyrosine kinases and phosphatidylinositol3-kinase in NIH-3T3 fibroblasts[J]. Biol Chem, 1997,272:31 196-31 202.

[22] Michael C L, Arif J, Shao C, et al. The roles of MAPKs in disease[J]. Cell Res, 2008,18(4):436-442.

[23] Chen Y C, Tsai S H, Shen S C, et al. Alternative activation of extracellular signal-regulated protein kinases in curcumin and arsenite-induced HSP70 gene expression in human colorectal carcinoma cells[J]. Eur J Cell Biol, 2001,80,213-221.

[24] Taylor A R, Robinson M B, Gifondorwa D J, et al. Regulation of heat shock protein 70 release in astrocytes: role of signaling kinases[J]. Dev Neurobiol, 2007,67:1 815-1 829.

[25] Jill M K, June F E, Evan T K. Heat stress-induced heat shock protein 70 expression is dependent on ERK activation in zebra fish( Danio rerio) cells[J]. Comp Biochem Phys, 2008,150(3):307-314.

[26] Sahin K, Orhan C, Akemir F, et al. Tomato powder supplementation activates Nrf-2 via ERK/Akt signaling pathway and attenuates heat stress-related responses in quails[J]. Anim Feed Sci Tech, 2011,165(3-4):230-237.

[27] Maroni P, Bendinelli P, Zuccorononno C, et al. Cellular signaling after in vivo heat shock in the liver[J]. Cell Biol Int, 2000,24:145-152.

[28] Gorostizaga A, Brion L, Maloberti P, et al. Heat shock triggers MAPK activation and MK8P-1 induction in Leydig testicular cells[J]. Biochem Bioph Res Co, 2005,327:23-28.

[29] Gourgou E, Aggelii K, Beis I, et al. Hyperthermia induced Hsp70 and MT20 transcriptional upregulation are mediated by p38-MAPK and JNKs in Mytilus galloprovincialis(Lamarck); a prosurvival response[J]. J Exp Biol, 2010,213:347-357.

[30] Banerjee M S, Chakraborty P K, Dey R S, et al. Heat stress upregulates chaperone heat shock protein 70 and antioxidant manganese superoxide dismutase through reactive oxygen species (ROS) p38MAPK and Akt[J]. Cell Stress Chaperone, 2009,14:(6)579-589.

[31] Han S I, Oh S Y, Jeon W J, et al. Mild heat shock induces cycin D1 synthesis through multiple Ras signal pathways[J]. FEBS Lett, 2002,515:141-145.

[32] Kurata S. Selective activation of p38 MAPK cascade and mitotic arrest caused by low level oxidative stress[J]. Biol Chem, 2000,275:23 413-23 416.

[33] Scheeff D E, Bourne P E. Structural evolution of the protein kinase-like superfamily[J]. PloS Comput Biol Nlm, 2005,1(5):49.

[34] Kennedy S G, Wagner A, Conzen S D, et al. The PI3-kinase/Akt signaling pathway delivers an anti-apoptotic signal[J]. Genes Dev, 1997,11:701-713.

[35] Brazil D P, Hemmings B A. Ten years of protein kinase B signaling: a hard Akt to follow[J]. Trends Biochem Sci, 2001,26:657-664.

[36] 刘吉茹,朱宇旌,邵彩梅,等.磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号途径及其在肌肉生长发育中的调控机制[J].动物营养学报,2013,25(4):692-698.

[37] Yoshihara T, Naito H, Kakigi R, et al. Heat stress activates the Akt/mTOR signaling pathway in rat skeletal muscle[J].Acta Physiol (Oxf), 2013,207(2):416-426.

[38] Wei H, Richard S, Vander H. Heat stress activates Akt via focal adhesion kinase-mediated pathway in neonatal rat ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2008,295:561-568.

[39] Li P C, Yang C C, Hsu S P, et al. Repetitive progressive thermal preconditioning hinders thrombosis by reinforcing phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent heat-shock protein/endothelial nitric oxide synthase signaling[J]. J Vasc Surg, 2012,56(1):159-170.

[40] 孙桂丽,王大鹏.蛋白激酶C在细胞及肿瘤细胞凋亡中的作用[J].中国组织工程研究与临床康复,2009,13(7):1 360-1 363.

[41] Boellmann F, Thomas R S. The Identification of Protein Kinase C Iota as a Regulator of the Mammalian Heat Shock Response Using Functional Genomic Screens[J]. PLos one,2010,5(7):1-7.