高效液相色谱质谱联用仪分析不同产地蜂胶的多酚类成分（续）

罗照明 张红城 （译）

（中国农业科学院蜜蜂研究所，北京100093）

（接2013年《中国蜂业》上旬第1期）

不同地区蜂胶的290nm的HPLC色谱图如图2所示。来自于南美洲的蜂胶（A）和欧洲的蜂胶（C）的化学成分相近，而与大部分的巴西蜂胶差别明显。欧洲蜂胶的特点是含有大量的酚酸 （表 2，峰 1－5，9，19，22a－24，31－34，36，43，44）和黄酮（ 表 2,峰 6－8，10－18，20－22，25－30，35，37－42）。很多的化学成分也出现在亚洲蜂胶（如中国）和阿根廷蜂胶。相比之下，巴西蜂胶有明显的模式。在绿色蜂胶和Silvestre蜂胶中的阿替匹林C（峰53）、P-香豆酸的异戊二烯衍生物（峰56）及不同的咖啡酰奎尼酸（表2，峰45－48）是主要的成分，其中还含有少量的4-羟基-3-异戊二烯肉桂酸、异平基-P-香豆酸酯（峰50），山奈素（峰52），一个肉桂酸的衍生物（峰 54），一个色满（chroman）衍生物（峰55）及一个香豆酮衍生物（峰57）。在巴西红蜂胶里检测出的少量的黄酮，有总含量少于0.2%的鹰嘴豆素A（Biochanin A）和芒柄黄花素（Formononetin），还有一些被Piccinelli等报道过的异黄酮。

蜂胶里大部分化合物是通过与标准品的色谱保留时间和紫外光谱对照来进行确认的。没有标准品的未知成分，通过色谱联合的紫外数据及质谱进行确认。色谱法和紫外光谱能够保证区分不同级别的多酚。事实上，在反相色谱的条件下，由于羟基化和甲基化的位置及数量不同，不同的黄酮被分离开来。羟基数量的增加会降低保留时间，而除了甲基在C5位置，甲基化数量的增加会增加保留时间。而且，烷酮醇（如短叶松素），黄酮（柯因），黄烷酮（如松属素）比相应的黄酮醇（如高良姜素）先洗脱出来。

考虑到紫外光谱特征，肉桂酸衍生物典型的最大紫外吸收峰在275～325nm范围。相比之下，黄酮醇和黄酮最大的紫外吸收峰分别在265/358和268/310nm，这些容易区别，但是烷酮醇（UVmax290 nm）和黄烷酮（UVmax292 nm）不容易辨别。

分子离子峰及一些特殊的离子碎片作为进一步确认未知化合物参考的方法。MS/MS在阴离子模式和阳离子模式进行，因为多酚化合物的每一组离子碎片不同。肉桂酸在阳离子模式下产生离子峰[M－H2O]+，在阴离子模式下产生离子峰[M－COOH]－。然而，肉桂酸酯主要在阴离子模式下产生离子碎片。例如，咖啡酸苄酯（峰 23）产生离子峰[m/z]－179（caffeic acid）[m/z]－161（caffeic acid－H2O）and[m/z]－135（caffeic acid－COOH）。

如果黄酮醇，黄烷酮及黄酮在A环上没有取代基，就会产生阴离子峰[m/z]－151和阳离子峰[m/z]+153。不同的黄酮类都会有一个共同的离子峰[m/z]－151，它来源于A环的逆狄尔斯-阿尔德反应。但是黄酮醇的离子峰不同，如短叶松素。它们产生一个离子峰[m/z]－253[M－H2O]－，H2O的缺失是因为C环上C3位置存在羟基。类似的情况，5-甲氧基短叶松素乙酸酯（峰18）在低能量碰撞下产生离子峰[m/z]－285[M－acetate]－，[m/z]－267[M－acetate－H2O]－，[m/z]－253[M－acetate－H2O-CH3]－（图3）。在高的碰撞能量下只产生离子峰[m/z]－253。相似分裂模式也存在于短叶松素的酯类，如短叶松素-3-丙酸酯（图4，峰35）。峰8需要特别说明，因为它的紫外光谱特征表明其为槲皮素的衍生物，分子离子峰[m/z]－315也说明其为一个甲氧基槲皮素。这个甲氧基的位置不可能在B环上的C3'，事实上，3'-甲氧基槲皮素就是异鼠李素，它的保留时间与峰8不同。另一方面甲氧基不能在A环，因为MS/MS产生一个离子峰[m/z]－151，从而排除了甲氧基的这个位置。因此，峰8只能为3-甲氧基槲皮素（甲氧基位于C环C3位置），基于紫外光谱特征，结合分子离子峰[m/z]－299，离子碎片[m/z]－255[M－COOH]－和[m/z]+245[M－CH2COOH]+，峰53可以鉴定为阿替匹林C。通过对紫外光谱特征（典型的P-香豆酸衍生物）及离子碎片[m/z]－187[M－COOH]－和 [m/z]+215[M－H2O]+分析，可以认为峰50是异平基结合到P-香豆酸的一个化合物。

3.4 蜂胶中黄酮和酚酸的含量

不同地区来源的不同蜂胶样品中的总黄酮和总酚酸含量汇总如表3。通过可以得到的标准品制作标准曲线来测定黄酮和酚酸的含量。短叶松素及其酯类用短叶松素标准曲线进行实验检测，它们的含量通过分子量比例来换算。按类似的方法，咖啡酸和P-香豆酸的酯类含量分别用咖啡酸和P-香豆酸标准曲线测定。除了巴西蜂胶的黄酮含量很低之外，大部分地区黄酮含量较高，如柯因 （2～4%），松属素（2～4%），短叶松素乙酸酯 （1.6～3%）及高良姜素 （1～2%）。单从黄酮含量考虑，黄酮含量低于11%的蜂胶可以认为是次品的；黄酮

含量介于11～14%之间的为可以接受的，黄酮含量介于14～17%，及大于17%可分别认为是好的及高质量的。另一方面，肉桂酸衍生物（如P-香豆酸酯及CAPE）对人的身体健康有着显著的积极的影响；因此，对于它们的定性和定量具有重要的意义。

表2 不同来源的蜂胶样品中分离鉴定的化合物及其RT，UV，MS和MS/MS特征

表3 不同地区蜂胶的总黄酮和酚酸的含量（g/100g）

4 总结

不同地区的蜂胶含有不同的化学成分，阴离子模式下的LC-DAD-MS方法是鉴别和筛选蜂胶的有效的指纹识别方法。而且，结合MS和碰撞产生的碎片离子（CID-Ms2）可用于结构的鉴定，特别是没有标准品的化合物。尽管多酚代表着大多数蜂胶的成分，但本实验结果表明，黄酮类物质可作为评价蜂胶质量的参考物。

考虑到巴西蜂胶含有的黄酮很少，酚酸类（如artepillin C）可以用于评价其蜂胶的质量。本实验方法可以考虑应用于蜂胶原料及其作为不同商业用途的筛选。