融合蛋白XE-TNFαm2对SIV的抑制作用

蒋 虹，张伟伦，王 卫，薛 婧，丛 喆，卢圣栋，魏 强，陈伟京

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，北京 100021;2.中国医学科学院基础医学研究所，北京 100005)

XE-TNFαm2是一种靶向融合蛋白。XE是HIV/SIV辅助受体CXCR4胞外的第二个结构域，该结构域含 27 个氨基酸，能够与 gp120 结合［1－4］。TNFαm2是肿瘤坏死因子(TNFα)的突变衍生物，通过与细胞表面受体结合介导细胞凋亡，现已应用于恶性肿瘤的治疗［5－6］。本文通过 XE-TNFαm2 与猴免疫缺陷病毒(SIV)、CEMx-174细胞共同培养，测定细胞培养液中的P27抗原、SIV阳性细胞率及细胞存活率等，从而在细胞水平上评价XE-TNFαm2对艾滋病毒的中和作用及杀伤作用。

1 材料和方法

1.1 细胞、病毒和药物

1.1.1 细胞:CEMx-174细胞(由中国医学科学院医学实验动物研究所艾滋病实验室提供)，细胞培养液为含有10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U青链霉素的RPMI-1640(Hyclone)培养基。

1.1.2 猴免疫缺陷病毒SIVmac251毒株:由中国医学科学院医学实验动物研究所艾滋病实验室提供，100 TCID50。

1.1.3 测试药物:XE-TNFαm2(由中国医学科学院基础医学研究所提供);阳性对照药:齐多拉米双夫定(GlaxoSmithKline，Australia Pty Ltd)。

1.2 XE-TNFαm2对CEMx-174细胞的毒性试验

XE-TNFαm2蛋白和阳性对照药毒性实验的起始稀释浓度分别为500 μg/mL 和1 mg/mL，1∶2等比例系列稀释，各稀释度药物加到培养板中，每孔再入4×105的CEMx-174细胞置37℃二氧化碳培养箱培养，每天观察细胞病变情况。第5天在培养板中加入CCK-8(同仁化学研究所公司)，每孔10 μL，另设空白对照孔(孔中不含细胞)。将96孔培养板置于37℃、二氧化碳培养箱中反应3 h后，用酶标仪测定波长为540 nm时的吸光度值。按 Reed Muench计算药物对细胞的毒性浓度，最大无毒浓度(TD0)，半数中毒浓度(TD50)。

1.3 抗病毒实验

将XE-TNFαm2和齐多拉米双夫定从最大无毒浓度1∶2等比例系列稀释，各稀释度与100TCID50病毒混匀后37℃作用30 min，再加入CEMx-174细胞和细胞培养液，放置于37℃二氧化碳培养箱培养，第2天和第4天换一半培养液(培养液中含有相应浓度的药物)。每天观察细胞病变。培养第5天进行指标测定。

1.3.1 ELISA检测P27抗原:药物抗病毒实验第5天，取培养上清100 μL于24孔板中，用P27抗原ELISA检测试剂盒(ZeptoMetrix Corporation)检测每孔P27抗原量，计算抗病毒抑制率。

1.3.2 间接免疫荧光法测试SIV阳性细胞:药物抗病毒实验第5天，收集细胞板中各实验孔的细胞进行涂片，再经丙酮4℃固定30 min。固定后的细胞片加上猴抗SIV多抗(1∶100本室制备)，37℃孵育30 min，用pH 7.2磷酸缓冲液(PBS)洗片3次，加荧光标记的兔抗猴抗体(Sigma)，37℃孵育30 min，PBS洗片3次，用50%甘油封片。荧光显微镜观察荧光细胞并计数，计算SIV阳性细胞百分率。

1.3.3 流式细胞技术法测试SIV阳性细胞:药物抗病毒实验第5天，收集1×106细胞悬液1 500 r/min离心5 min，细胞中加入猴抗SIV多抗5 μL，作用30 min，PBS洗2次，1 500 r/min离心5 min去上清液，加入荧光标记的兔抗猴抗体(1∶400)1 μL，作用30 min，PBS洗2次，1 500 r/min离心5 min去上清液，加PBS至 400 μL，流式细胞仪测试 SIV阳性细胞数。

1.3.4 细胞凋亡:采用BD公司的PE-annexin V凋亡检测试剂盒(No:559763)检测细胞凋亡情况。收集待测细胞，以预冷的PBS清洗细胞两次，调整细胞密度至1×106/mL，用1×结合溶液重悬细胞。在流式管中加入细胞悬液100 μL(1×105细胞)，每管加入 5 μL PE-annexin V 和 5 μL PerCP-7AAD，室温避光孵育15 min，然后每管加入400 μL 1×结合溶液，1 h内用流式细胞术检测凋亡细胞百分率。

2 结果

2.1 XE-TNFαm2对细胞的毒性结果

用CCK-8试剂盒检测XE-TNFαm2蛋白和阳性对照药物对CEMx-174细胞的毒性，结果显示500～1.95 μg/mL浓度的A值与细胞对照的A值差异没有显著性，说明蛋白在此浓度范围内对细胞没有毒性反应。阳性对照药物的TC50为847.878 μg/mL。

2.2 对SIV病毒的抑制作用

XE-TNFαm2与病毒和细胞共培养后第5天，实验孔培养上清用P27抗原ELISA盒测试P27抗原量。XE-TNFαm2 剂量 50、25、12.5 μg/mL 时，对SIV病毒的抑制率分别为40.3%、24.9%、14.1%、12.2%和5.1%，阳性药对照无毒浓度对病毒的抑制率最高为97.48%(图1)。

图1 ELISA测试P27抗原的病毒抑制率Fig．1 Inhibition of P27 antibody production，ELISA measurement

收集XE-TNFαm2实验组、阳性药对照组及SIV对照组的细胞，用流式细胞术和IFA方法检测SIV阳性细胞率。流式细胞术结果(表1)显示，XETNFαm 剂量50、25、12.5 μg/mL 时 SIV 阳性细胞率比SIV对照有不同程度的下降，分别为21.6±2.54、29.95±5.72、42.4 ±7.35。阳性对照药在药物浓度50～3.125 μg/mL范围内的SIV阳性细胞率为9.105% ～15.275%。IFA测试结果显示，XETNFαm2实验组的5个浓度的SIV阳性细胞率与SIV病毒对照相比都有所下降，当XE-TNFαm2浓度为50 μg/mL时，SIV阳性细胞率为33%，SIV对照为77.16%。阳性对照药浓度在50～3.125 μg/mL范围内，未见SIV阳性细胞。

2.3 细胞存活率和细胞凋亡作用

XE-TNFαm2实验组，流式细胞术检测的活细胞率和凋亡细胞率的结果显示(图2)，5个不同剂量组(50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL)中细胞存活率分别为64.5%、54.1%、30.6%、23.6%和23.7%，细胞早期凋亡率分别为14.5%、18.9%、30.4%、37.1%和36.3%。SIV的细胞存活率为45.3%。凋亡率为22.3%。

3 讨论

本实验中，我们通过 XE-TNFαm2、SIVmac251和CEMx174细胞共培养方式，利用流式细胞术和IFA方法，对XE-TNFαm2抑制病毒和杀伤病毒感染细胞的能力进行评价。

图2 流式细胞仪测试细胞存活率和细胞凋亡率Fig．2 The survival and apoptosis rates of viable cells detected by flow cytometry

实验结果表明XE-TNFαm2可以使病毒感染细胞的能力降低，致使活细胞数增高，从而起到抑制病毒的作用。从测试XE-TNFαm2、细胞和病毒共培养的培养上清的P27抗原量的结果和病毒感染的gp120阳性细胞的测试结果可以看出，XE-TNFαm2对病毒的抑制作用与XE-TNFαm2剂量关系呈正向递减趋势，最高病毒抑制率可以达到40%。

从流式细胞术测试活细胞和凋亡细胞结果分析来看，与病毒对照(SIV)相比较，在蛋白浓度50、25 μg/mL时，XE-TNFαm2的抗病毒作用以对病毒的抑制作用为主要作用方式，这与流式细胞仪和涂片IFA测试SIV阳性细胞的结果(表1)相一致。当XETNFαm2 剂量降低于 12.5、6.25、3.125 μg/mL 时，细胞的凋亡率与病毒对照相比有明显升高(图2);高浓度表现出较低的细胞凋亡率可能是蛋白XE-TNFαm2导致大量感染细胞死亡而不易检出。

表1 XE-TNFαm2实验组、阳性药对照及SIV对照的SIV阳性细胞率Tab．1 Positive rate of SIV-infected cells in different groups

无论是对病毒的抑制、杀伤作用还是对病毒感染细胞的杀伤作用都与XE-TNFαm2剂量有明显的依赖关系，表现 XE-TNFαm2靶向融合蛋白的特性［7］。

综合结果提示，XE-TNFαm2除了具有抑制病毒作用外，对病毒感染细胞还具有诱导细胞凋亡杀伤作用，药物剂量与对照结果出现一定的偏差原因，有待进一步研究。

［1］ Simon JHM，Stumbles P．Role of CD4 epitopes outside the gp120-binding site during entry of human immunodeficiency virus type 1［J］．J Virol，1997，71(2):1476 － 1484．

［2］ Mbah HA，Burda S，Gorny MK．Effect of soluble CD4 on exposure of epitopes on primary， intact， native human immunodeficiency virus type 1 virions of different genetic clades［J］．J Virol，2001，75(16):7785 － 7788．

［3］ Esser U，Speck RF，Deen KC，et al．Molecular function of the CD4 D1 domain in coreceptor-mediated entry by HIV type 1［J］．AIDS Res Hum Retroviruses．2000，16(17):1845 －1854．

［4］ Brinkworth RI，Ramsdale TE，Palant E．A model of the CD4-binding domain of gp120［C］．Int Conf AIDS．1993，Jun 6 －11;(abstract no．PO-A01-0001)．Queensland，Australia．

［5］ Nakamura S，Kato A，Masegi T，et al．A novel recombinant tumor necrosis factor-alpha mutant with increased anti-tumor activity and lower toxicity［J］．Int J Cancer．1991，48(5):744－748．

［6］ Duh EJ，Maury WJ，Folks TM，et al．Tumor necrosis factor alpha activates human immunodeficiency virus type 1 through induction of nuclear factor binding to the NF-kappa B sites in the long terminal repeat［J］．PNAS 1989，86:5974 －5978．

［7］ 路金芝，陈伟京．靶向融合蛋白XE-TNFαm2导致受HIV/SIV感染细胞的凋亡［J］．中国生物工程杂志，2009，29(3):9－13．