大鼠仙台病毒ELISA、间接免疫荧光和免疫印迹三种检测方法比较

向志光，佟 巍，李雨函，刘先菊，张丽芳，王艳蓉，魏 强

(中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部实验动物检测中心，北京 100021)

我国实验动物国家标准要求对清洁级以上的啮齿类实验动物进行仙台病毒检测［1］，规定的检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫荧光试验(IFA)等［2］。两种方法分别以吸光度和荧光强度显示特异性抗原抗体反应，本质相似。然而在实际应用中部分样品由于存在非特异结合，导致使用单一方法难以对这类样品做出准确判断。WB方法将病毒的抗原成分按照分子量进行分离，可以更好的识别血清样品中的特异结合，因此被美国Charles river等机构用作可疑样品的鉴定方法。

本研究在国内首次对仙台病毒使用WB方法进行了抗原蛋白分析，确认了仙台病毒的特异性抗原。使用IFA、ELISA和 WB3种方法对无菌大鼠、SPF级大鼠以及清洁级大鼠血清样品进行测定，对3种方法的应用进行了比较。

1 材料和方法

1.1 WB的建立方法

仙台病毒抗原蛋白纯化方法参照本中心ELISA试剂盒制备抗原的方法［3］，制备常规12%聚丙烯凝胶，使用12道电泳槽(AE-6450，ATTO)，11道上样仙台病毒抗原蛋白10 μg，20 mA恒流电泳，至预染分子量标准(sm0671，Fermentas)达到预定位置。凝胶分离蛋白经300 mA恒流转移1 h至NC膜，将此膜固定于多道杂交器 (AE-6195，ATTO)，使预染分子量标准清晰展示于边侧一道。含有仙台病毒抗原的11道，每道加入1∶100稀释的大鼠血清样品200 μL，稀释液为含脱脂奶粉3%的PBST。4℃孵育过夜。PBST 3×10 min洗膜后，和HRP标记的兔抗大鼠IgG抗体室温杂交1 h。PBST 4×10 min洗膜后，经 ECL曝光显影至乳胶片。

1.2 ELISA和IFA检测方法

大鼠仙台病毒ELISA抗体检测方法参见本中心制备的小鼠仙台病毒ELISA抗体检测试剂盒检测方法［3］，将酶标记物变更为HRP标记的兔抗大鼠IgG抗体。阴性上限判定值为阴性对照OD450读值+0.15。IFA方法采用实验动物国家标准推荐方法［2］，以感染仙台病毒的BHK-21细胞包被玻片，和1∶40稀释的待检血清样品反应，之后用荧光标记物显示特异结合，同时设BHK-21细胞对照，排除非特异结合的影响。

2 结果

2.1 仙台病毒蛋白经SDS-PAGE展示可显示血清样品中抗病毒抗体特异结合

经差速离心分离的仙台病毒经超声处理后和含SDS的上样缓冲液混合处理后进行凝胶电泳，并转移至NC膜上。和仙台病毒抗体阴性的大鼠血清共孵育没有特异性杂交(图1A，N泳道);和仙台病毒抗体阳性的大鼠血清样品共孵育显示出特异条带(图1A，P泳道)，包括分子量70 ×103的条带(箭头a所示)和分子量57×103的条带(箭头b所示)。以此方法检测待检血清样品，结果发现无菌大鼠血清和仙台病毒无特异性杂交(图1B，1～3泳道)，而来自清洁级的仙台病毒抗体阳性的大鼠血清(经IFA方法证实)可以和NC膜展示的仙台病毒抗原特异性结合(图1B，4～9泳道)，包含70×103和 57×103的特异条带。

2.2 WB方法的敏感性

使用IFA、ELISA和WB3种方法检测20份无菌大鼠血清样品，均不能做出阳性判断(表1)。对227份SPF级大鼠血清样品进行检测，ELISA方法检测3份阳性样品，其中2份经WB检测亦为阳性，而以IFA方法检测没有样品做出阳性判断。对63份清洁级大鼠血清样品进行检测，ELISA方法检测出仙台病毒抗体阳性的样品10份，而WB方法检出仙台病毒抗体阳性样品7份，IFA方法检出仙台病毒抗体阳性样品5份。ELISA、IFA和WB在普通环境大鼠检出仙台病毒抗体的阳性率分别为为18.12%、11.34%和15.87%。

部分血清样品使用IFA方法和WB检测的结果如图2所示。来自无菌大鼠的血清样品(a)被IFA和WB方法均作出阴性判定;而仙台病毒接种大鼠的血清(b)在IFA和 WB方法中均显示为阳性;来自清洁级大鼠血清c和d在WB方法中作出阳性判定，而在IFA方法中样品c做阳性判定而d样品做可疑判定;而部分 SPF大鼠样品(e，f)，ELISA方法不能做阴性判定，在IFA方法中不能做阳性判定，而在WB方法中却被判定为可疑样品。

3 讨论

实验动物国家标准推荐ELISA和IFA等血清学检测方法对实验动物病毒性病原体感染情况进行检测。理想的检测方法应能够对动物感染病毒的状态做出判定，然而有诸多原因导致血清学检测的不确定性:动物感染病原体的窗口期抗病毒抗体的滴度低，普通方法难以检测;某些动物罹患特殊疾病，自身抗体水平高，导致非特异反应和较高的背景值;待检样品采集时存在溶血等情况而影响了样品质量;全病毒颗粒的不同抗原成分存在其他病原体的交叉抗原表位，病原体特异性抗原的纯度低等。这些因素有些是可以控制的，比如血清样品的采集质量;而有些是所有方法都难以解决的，如动物病毒感染的窗口期等。ELISA和IFA方法采用了的颜色反应和荧光强度的判定，对于交叉抗原和特异抗原纯度低的问题难以解决，因此有必要使用其他方法对阳性及可疑样品进行验证。

图1 仙台病毒免疫印记检测方法的开发。Fig.1 The development of Western blot method for SeV detection．

表1 三种检测方法对不同来源大鼠血清样品的检测结果Tab.1 Results of rats sera from different facilities by 3 methods

图2 不同来源大鼠血清IFA和WB检测结果。Fig.2 The IFA(A)and WB(B)results of rat sera from different facilities．

仙台病毒、小鼠肝炎病毒等是啮齿类实验动物经常检出的病毒性病原体。本文的研究表明仙台病毒抗原经SDS-PAGE按照分子量进行分离，暴露了主要的抗原蛋白条带如70 ×103和57 ×103的两个抗原蛋白(图1A)，符合仙台病毒 HN抗原和NP 抗原的分子量大小，和文献报道一致［4，5］。在WB的检测方法中可以作为主要的判定标准。在ELISA和IFA两种方法中由于抗原纯度的限制而对某些感染情况难以判断，但是在WB方法中可以较好的区分非特异杂交的背景和核心抗原条带的杂交，如图2B所示的样品 d和 e，虽然存在一定的非特异背景，但是可以辨识出核心抗原条带的阳性杂交，因此可以判定为仙台病毒可疑样品。对于这些样品，WB方法判定的准确性要高于 ELISA和 IFA的方法。而对于任意一种方法检测出的阳性以及可疑样品，对于采样的实验动物群体来说都需慎重处理:增加采样量，采用不同方法以做出诊断无论对于繁育群体还是研究群体都是有重要意义的。

本文仅就仙台病毒一种病毒性病原体比较分析了ELISA、IFA和WB方法的在检测工作中的适用性，对于其他病毒的情况需要做进一步的研究。

［1］ 国家标准:实验动物 微生物学等级及监测，GB14922.2－2011．

［2］ 国家标准:实验动物 仙台病毒检测方法，GB/T 14926.23－2001．

［3］ 向志光，佟巍，刘先菊，等．小鼠仙台病毒ELISA抗体检测规范化试剂盒的研制与应用［J］．中国比较医学杂志，2012，22(11)42－47．

［4］ Mizuguchi H，Nakanishi T，Kondoh M，et al．Fusion of Sendai virus with liposome depends on only F protein，but not HN protein［J］．Virus Research，1999，59:191 －201．

［5］ Ogino T，Iwama M，Kinouchi J，et al．Involvement of a Cellular Glycolytic Enzyme，Phosphoglycerate Kinase，in Sendai Virus Transcription［J］．Journal of Biological Chemistry，1999，274(50):35999－36008．