不同补肾法对BMSCs向神经元样细胞分化的影响

张月梅 颜春鲁 刘永琦 苏 韫 范 萍 吴晓晶 董介正

视网膜缺血是视网膜光感受器细胞层凋亡的主要原因之一，是严重威胁视力的临床常见眼底疾病，至今仍无有效的治疗方法来阻止或逆转这类疾病的退行性改变。寻找非视网膜来源的、可替代视网膜光感受器细胞功能的细胞作为理想移植供体是目前需要攻克的难题。

骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有向心肌细胞、神经干细胞样细胞等分化能力〔1〕，已成为骨科、心血管科、神经科、眼科等治疗的主要种子细胞之一〔2-4〕。中医药素有滋阴补阳、强身壮体、增智健脑、抗衰老和调节免疫功能之功效。本课题用不同补肾法（补益肾阴法、阴阳双补法、补益肾阳法）代表方药左归丸、地黄饮子、右归丸含药血清孵育BMSCs，观察不同补肾方药对BMSCs的诱导分化作用，从而筛选出可高效诱导BMSCs向神经元样细胞分化的补肾法及代表方药。

1 材料和方法

1.1 实验动物

提取BMSCs的动物：SPF级Wistar大鼠15只，雌雄不限，体重（120±10）g。制备含药血清的动物：SPF 级 Wistar大鼠 40 只，雌雄不限，体重（250±20）g。以上动物皆由甘肃中医学院实验动物中心提供，实验动物质量合格证号：SCXK（甘）2004-0006。

1.2 实验药物

左归丸、右归丸、地黄饮子均购自甘肃中医学院附属医院药剂科，经中药教研室鉴定，均为正品。

1.3 主要药品试剂与仪器

L-DMEM 培养基（GⅠB-CO Ⅰnvitrogen Corporation，批号1240031），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批号 090123），0.25%胰酶（Sigma），L-谷氨酰胺（上海新兴医药保健品科技开发中心，批号 991085），全反式维甲酸（Sigma），CD45 荧光标记抗体（Gibco公司），CD90荧光标记抗体（Gibco公司），Nestin、NSE、GFAP 免疫组化试剂盒；二氧化碳培养箱（SANYO Electric Co.Ltd，型号 MOA-18ALC），超净工作台（苏州净化仪器厂，型号SW-CJ-2FD），流式细胞仪（美国贝克曼公司）。

1.4 BMSCs的分离培养、鉴定

采用全骨髓贴壁筛选法分离培养、纯化BMSCs，经流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD90及造血干细胞表面标志CD45的表达率。

1.5 中药含药血清的制备

40只Wistar大鼠，随机分为4组：空白组、左归丸全药组（补益肾阴法代表方药）、地黄饮子全药组（阴阳双补法代表方药）和右归丸全药组（补益肾阳法代表方药）。晚禁食，第2天，空白组给生理盐水，其余组给药液（剂量按1 g生药/100 g大鼠），连续3 d，2次/d；于第3天给药后2 h从股动脉取血，分离血清 （3 000 r/min，10 min），56 ℃灭活 30 min，0.22 μm滤器过滤除菌，分装，-20℃保存备用。

1.6 对F3代BMSCs进行补肾方药含药血清孵育

将已纯化的BMSCs（F3代）接种至培养瓶中，待细胞70%～80%融合后，弃完全培养液，随机分组，分别用含10%左归丸、右归丸、地黄饮子中药血清和维甲酸的L-DMEM培养液孵育，连续培养3 d。将诱导的BMSCs用0.25%的胰酶消化，待细胞变形、间隙增大，加入含10%胎牛血清的DMEM中止消化，磷酸盐缓冲液轻洗，吹打成1×106个/ml细胞悬液，备用。

1.7 诱导后细胞神经标志蛋白检测

诱导后细胞随机分为8组，分别为空白诱导组、左归丸诱导组、地黄饮子诱导组、右归丸诱导组、维甲酸（retinoic acid,RA）诱导组、左归丸联合RA诱导组、右归丸联合RA诱导组、地黄饮子联合RA诱导组。按时间段分为2个阶段，第1阶段于诱导后5 h，第2阶段于诱导后72 h，进行免疫细胞化学[巢蛋白（Nestin）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）检测。光学显微镜观察并拍照。以Nestin抗原表达鉴定神经干细胞，NSE抗原表达鉴定分化形成的神经元，GFAP抗原表达鉴定分化形成的胶质细胞，此三者均为胞浆表达。免疫细胞化学检测采用SABC改良法进行。

免疫组织化学结果判定：细胞浆中呈棕黄色颗粒者为阳性细胞。显微镜下计数，随机选取3张片子，每张片子随机选取5个非重叠视野（100倍），阳性细胞率（%）=阳性细胞数÷（阳性细胞数＋阴性细胞数）×100%。

1.8 统计学分析

应用SPSS 16.0软件进行统计分析，数据均采用均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析，SNK-q检验进行两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠BMSCs的形态及CD90、CD45的表达

F3代细胞形态单一均匀，融合后呈典型的极性，漩涡状生长（图1）。经流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD90及造血干细胞表面标志CD45的表达，CD90＋、CD45-细胞为 97.0%（图 2）。

2.2 诱导后细胞神经标志蛋白的表达水平

诱导后除空白组及右归丸组外，其余各组BMSCs胞体不同程度收缩，突起伸出；免疫组化显示，各药物诱导组的细胞Nestin、NSE、GFAP均有不同程度的阳性表达。

2.2.1 诱导后细胞Nestin的表达水平：诱导5 h、72 h时，与空白组、右归丸组比较，其余各药物诱导组Nestin均明显升高（P＜0.01），其中以地黄饮子联合维甲酸组、左归丸联合维甲酸组的Nestin表达为最高（P＜0.01）。药物诱导72 h时，地黄饮子单独及联合维甲酸诱导组、左归丸组的Nestin表达高于本组药物诱导 5 h 时的结果（P＜0.05）（表1）。

表1 不同药物诱导大鼠BMSCs不同时间后Nestin 的表达水平（±s，%）

表1 不同药物诱导大鼠BMSCs不同时间后Nestin 的表达水平（±s，%）

注：同一列不同字母者间比较，P＜0.01（SNK-q检验）；5 h与72 h组内比较，①P＜0.05（单因素方差分析） BMSCs：骨髓间充质干细胞

2.2.2 诱导后细胞NSE的表达水平：与空白组、右归丸组比较，诱导5 h时，3种中药血清联合维甲酸组及单纯维甲酸诱导组NSE表达均明显升高（P＜0.01）；诱导72 h时，除上述4组外，左归丸组、地黄饮子组的NSE表达也明显高于空白组和右归丸组（P＜0.01），其中左归丸组的均值变化较为明显，与5 h时结果有统计学意义的差异（P＜0.05）。2个时间点中均以左归丸联合维甲酸组、地黄饮子联合维甲酸组的 NSE 表达为最高（P＜0.05）（表2）。

表2 不同药物诱导BMSCs不同时间后NSE的表达水平（±s，%）

表2 不同药物诱导BMSCs不同时间后NSE的表达水平（±s，%）

注：同一列不同字母，且同时带有“+”或同时带有“*”者间比较，P＜0.05；同一列不同字母，不同时带有“+”或“*”者间比较，P＜0.01（SNK-q检验）；5 h与 72 h组内比较，①P＜0.05（单因素方差分析）BMSCs：骨髓间充质干细胞

组别 样本数 5 h 72 h左归丸+维甲酸组 6 50.30±0.66c 53.20±3.30d地黄饮子+维甲酸组 6 53.60±5.01c* 57.37±1.10d*右归丸+维甲酸组 6 43.77±3.38b* 47.30±1.91b*左归丸组 6 23.53±8.40a 36.23±2.86bc①地黄饮子组 6 25.77±4.30a 32.63±3.04c+右归丸组 6 20.43±5.64a 19.53±2.32a维甲酸组 6 42.70±2.26b 42.37±2.04b+空白组 6 18.27±4.49a 19.17±3.83a

2.2.3 诱导后细胞GFAP的表达水平：各时间点不同药物诱导组间GFAP表达差异无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 不同药物诱导BMSCs不同时间后GFAP的表达水平（±s，%）

表3 不同药物诱导BMSCs不同时间后GFAP的表达水平（±s，%）

注：各组间比较，P＞0.05（SNK-q检验） BMSCs：骨髓间充质干细胞

组别 样本数 5 h 72 h左归丸+维甲酸组 6 10.07±2.04 11.27±2.11地黄饮子+维甲酸组 6 10.17±1.72 10.40±2.14右归丸+维甲酸组 6 9.93±1.65 11.07±2.28左归丸组 6 10.80±2.18 9.70±1.47地黄饮子组 6 8.97±1.54 11.10±2.16右归丸组 6 10.43±1.80 10.17±1.63维甲酸组 6 9.47±1.39 9.17±1.68空白组 6 8.53±1.62 8.73±1.60

3 讨论

《内经》 曰：“肾生骨髓”，“其充在骨”。《医经精义》曰：“肾藏精，精生髓”，“髓者，肾精所在，精足则髓足”。即肾精充足，则骨髓生化有源。若肾精虚少，则骨髓化源不足。

刘柏炎等〔5〕认为干细胞可归于中医正气范畴，胚胎干细胞与先天之精气有关。中医学的“精”在内涵上与干细胞有很大的相关性，干细胞具先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式。根据干细胞具先天之精属性理论及精生髓通脑理论，张进等〔5〕认为，来自骨髓的间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）与中枢神经系统的神经干细胞（neural stem cell，NSC）同属先天之精，它们能相互转化，补肾填精法可能会对这种MSC向神经元样细胞的分化起促进作用。陈东风等〔7〕报道大鼠MSC经龟板含药血清体外诱导后分化的神经元样细胞神经丝蛋白表达阳性，诱导12 h后，神经元样细胞阳性率达到高峰，细胞存活时间较长，至第7天仍有神经元样细胞存活。邝学媚等〔8〕报道三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠BMSCs分化也有类似发现。

基于以上“肾生髓”理论，在本实验中我们选用了补肾方药（补益肾阴方药左归丸，阴阳双补方药地黄饮子，补益肾阳方药右归丸）进行研究，探讨它们在体外促BMSCs向神经元样细胞分化中的作用。Nestin存在于神经上皮干细胞中，为神经干细胞的标志物；NSE主要存在于神经细胞中，为成熟神经细胞的标志物；GFAP存在于正常星形胶质细胞和反应性胶质细胞中，为构成成熟星形胶质细胞中间丝的主要成分。

实验研究结果表明，体外诱导5 h、72 h时，与空白组比较，各药物诱导组Nestin、NSE均明显升高，提示左归丸、地黄饮子、右归丸有诱导BMSCs向神经干细胞、神经元细胞及神经胶质细胞分化的可能性。不同补肾法能够促BMSCs向神经元样细胞分化，且补阴类代表方左归丸和阴阳双补类代表方地黄饮子诱导分化的效果优于补阳类代表方右归丸，这也正符合了中医“肾生髓，通于脑”理论实质。中医理论认为，肾“主骨、生髓、通于脑”，三者皆来源于先天的肾之精气；BMSCs来源于骨髓，而骨髓又属阴髓，故补益肾阴、阴阳双补法可促进BMSCs的增殖。

[1]Boettcher C，U lbricht E，Helm linger D，et al.Long-term engraftment of systemically transplanted，gene-modified bone marrow-derived cells in the adult mouse retina[J].Br J Ophthamlol，2008，92（2）：272-275.

[2]Baxter NN，Habermann EB，Tepper JE，et al.Risk of pelvic fractures in older women following pelvic irradiation[J].JAMA，2005，294（20）：2586-2593.

[3]Bianco P，Riminucci M，Gronthos S，et al.Bone marrow stromal stem cells：nature，biology，and potential applications[J].Stem cells，2001，19（3）：180-192.

[4]Leri A，Kajstura J,Anversa P.Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration[J].Physiol Rev，2005，85（4）：1373-1416.

[5]刘柏炎，蔡光先.试论中医学精气与干细胞生物学的关系[J].湖南中医学院学报，2003，23（6）：29.

[6]张进，徐志伟.补肾法诱导间充质干细胞向神经方向分化研究[J].现代医院，2004，4（9）：15-17.

[7]陈东风，杜少辉，李尹为，等.龟板含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元[J].广州中医药大学学报，2003，20（3）：224-226.

[8]邝学媚，廖欣，杜少辉，等.三甲复脉汤含药血清体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元[J].中国临床康复，2005，9（30）：53-55.