拉米夫定耐药感染者HBV基因与YMDD变异的相关性探讨

张志珊，蒋燕成，吴福林，王文杰，张 璇，林慧英，林毅胜＊

（1.福建医科大学附属泉州第一医院 检验科，泉州362000；2.泉州市中心血站，泉州362000）

拉米夫定是新一代抗病毒核苷类似物，它能有效地抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制，从而迅速降低血清HBV DNA水平。但长期使用容易使HBV P基因区的酪氨酸－蛋氨酸－天门冬氨酸－天门冬氨酸（YMDD）片段发生突变，使患者对拉米夫定产生耐药，导致治疗失败。目前，根据乙型肝炎病毒（HBV）全基因组序列差异≥8%，或S基因序列≥4%，将HBV分为A－H 8个基因型。不同的基因型与病毒复制及致病性、宿主免疫应答和临床表现、治疗与预后等都有一定的相关性。本文通过对拉米夫定治疗后无良好应答的慢性乙型肝炎感染者进行HBV基因型的测定，探讨HBV耐药株YMDD变异与基因型的相关性。

1 材料与方法

1.1 病例资料 2009年1月至2010年12月于本院接受抗病毒治疗后无良好应答的慢性乙型肝炎（CHB）患者162例，其中男126例，女36例，年龄20－62岁，平均31.3±10.8岁。诊断符合2000年修订的《病毒性肝炎防治方案》[1]的诊断标准。所有的患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎感染。所有血清置于－70℃保存。拉米夫定无良好应答者是指口服拉米夫定100mg／d，治疗6个月后病毒载量下降小于2lg IU／ml、病毒载量不降或反弹[2]。

1.2 试剂和仪器 核酸提取试剂由达安基因有限公司提供，Taq酶、dNTP为Takara公司产品，引物由上海生物工程有限公司合成，PCR扩增仪为eppendorf产品。HBV DNA荧光定量检测试剂盒为达安基因有限公司产品，YMDD变异检测试剂盒为上海复兴公司产品，采用美国贝克曼全自动生化分析仪检测ALT水平。实时荧光定量PCR仪ABI 7300为美国PE公司产品。

1.3 方法

1.3.1 HBV基因型的鉴定（1）核酸的提取：取血清50μl，加入50μl裂解液，100℃保温10分钟，13 000 rpm离心5分钟，上清即为HBV DNA。（2）DNA的扩增：采用套式PCR法对病毒S基因进行扩增。外 侧 引 物：5’－CCTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTC－3 ’ （nt22－77 ）， 5 ’－GGCGGCAAACCCCAAAAGACCC－3’（nt1004－1025）；内侧引物：5 ’－CTAG GACCCCTGCTCGTGTTACA－3 ’（nt181－203），5’－ATTACATATCCCATGAAGTTA AG－3’（nt870－892）。扩增条件：94℃ 5min，94℃30sec，55℃30sec，72℃60sec共35cycles循环，72℃5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送上海生物工程有限公司进行测序。（3）基因型鉴定：应用 Mega软件中 NJ（Neighbor－Joining）法进行系统进化树的构建并分析基因型。

1.3.2 HBV DNA 载量、YMDD变异、ALT 水平的检测 参照说明书进行。

1.3.3 统计学方法 用SPSS10.0统计学软件采用χ2检验和t检验法进行统计学分析。

2 结果

2.1 HBV基因型分布情况 162例对拉米夫定治疗后无良好应答的CHB感染者中，B基因型102例（63.0%），C基因型60例 （37.0%）。126 例 男 性HBV感染者中，B、C型的比例分别为64.2%（81／126）和35.8%（45／126）；36例女性感染者中，B、C型的比例分别为58.3%（21／36）和41.7%（15／36）。男女人群中，HBV基因型分布没有显著性差别（P＞0.05）。B型患者的年龄（29.7岁±10.2岁）明显低于C型患者的年龄（35.3岁±11.3岁），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 B、C型HBV感染者HBV DNA、ALT水平差异 C基因型CHB患者血清的HBV DNA含量显著高于B基因型（P＜0.05），而血清ALT水平没有显著性差别（P＞0.05），见表1。

表1 HBV B、C基因型患者血清HBV DNA、ALT水平差异

2.3 YMDD变异率及变异类型162例患者中，YMDD野生型51例（31.5%），发生YMDD变异的有 111 例 （68.5%），其 中 YIDD 变 异 30 例（18.5%），YVDD 变 异 32 例 （19.7%），YIDD／YVDD混合型变异49例（30.3%）。

2.4 CHB患者YMDD变异与基因型的关系 B基因型患者YMDD变异率为72.5%，C基因型患者YMDD变异率为61.7%，差异无统计学意义（P＞0.05）。B、C基因型患者YMDD 变异类型分布差异也无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 HBV B、C基因型患者YMDD变异情况[n（%）]

3 讨论

大量研究表明，HBV的基因型分布具有明显的地域性，不同的基因型具有其独特的流行病学特点和分子生物学特征，与乙型肝炎病毒复制及致病性、宿主免疫应答和临床表现、治疗与预后等都有一定的相关性。我国北方以C基因型为主，南方以B基因型为主，由北向南B型逐渐增多，而C型逐渐减少[3]。本结果显示，拉米夫定抗病毒治疗后无良好应答者的CHB患者B型占63.0%，C型占37.0%，本次调查中未发现其它型别的基因型，符合本地区HBV基因型的分布特点。不同性别患者基因型的分布没有显著差异，但是B基因型患者的年龄显著低于C基因型患者（P＜0.05）。

拉米夫定是临床上应用最为广泛的核苷类抗病毒药物，临床试验表明，拉米夫定（100mg／d）可有效地抑制HBV DNA的复制，同时伴有ALT正常，改善肝组织病变。但长期应用后可诱发HBV P区变异，从而产生耐药。YMDD变异有两种类型，分别是HBV P基因C区第739位碱基A→G和741位G→T突变而引起，从而导致第552位蛋氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）所取代，变成 M552V与M552I，即YVDD和YIDD变异。本研究结果显示，拉米夫定抗病毒治疗后无良好应答者的CHB患者，YMDD变异率达到68.5%，其中YIDD／YVDD混合型变异占44.1%（49／111），YIDD 变异与 YVDD变异分别为27.0%（30／111）和28.9%（32／111）。

目前对于拉米夫定耐药与HBV基因型的相关性尚无定论，谭文婷[4]等人认为不同基因型患者拉米夫定治疗后YMDD变异率没有相关性[5]。周建良等[5]则报道，B基因型YMDD变异的发生率低于C型，并认为基因型是诱导变异的重要因素之一。Pan等[6]研究显示 HBV YMDD变异与基因型无关。本研究结果显示，对拉米夫定无良好应答的CHB患者B、C基因型间YMDD变异率无明显差别（P＞0.05），B、C基因型间 ALT水平也没有明显差别（P＞0.05），但C基因型患者血清的 HBV DNA含量显著高于B基因型组（P＜0.05）。Yuen[7]等研究结果显示，B基因型的HBV能活化Th1细胞且抑制Th2细胞，而C基因型则相反，提示B基因型的HBV更能诱发人体的免疫反应，这可能是B基因型病毒载量较C基因型低的原因。

拉米夫定抗病毒治疗后无良好应答者的CHB患者中，YMDD变异是导致耐药的关键因素，虽然B、C基因与YMDD变异没有明显的相关性，但C基因型患者血清的HBV DNA含量显著高于B基因型组，可能也是导致CHB患者对拉米夫定无良好应答的原因之一。此外，年龄、免疫因素、YMDD以外其他位点的突变可能也是影响拉米夫定疗效的重要因素。

[1]中华医学会传染病与寄生虫病分会、肝病分会.病毒性肝炎防治方案[J].中华肝脏病杂志，2000，8：324.

[2]Lok AS，McMahon BJ.Chronic hepatitis B[J].Hepatology，2007，45：507.

[3]张爱民，王慧芬，王海滨，等.中国30个地区HBV基因型分布特点和临床意义[J].中华实验和临床病毒学杂志，2011，25（2）：126.

[4]谭文婷，邓国宏，王宇明，等.乙型肝炎病毒基因型对拉米夫定抗病毒疗效的影响[J].中华肝脏病杂志，2008，6（7）：540.

[5]周建良，吴诗品.慢性乙型肝炎病毒基因型与拉米夫定疗效关系的研究[J].中西医结合肝病杂志，2003，13（6）：332.

[6]Pan XP，Li LJ，Du WB，et al.Differences of YMDD mutational patterns，precore／core promoter mutations，serum HBV DNA levels in lamivudine－resistant hepatitis B genotypes B and C[J].J Viral Hepat，2007，14（11）：767.

[7]Yuen MF，Wong DK，Zheng BJ，et al.Difference in T helper response during hepatitis flares in hepatitis B antigen （HbeAg）－positive patients with genotypes B and C：implication for early HbeAg seroconversion[J].J Viral Hepat，2007，14：269.