八棱海棠类Caspase基因cDNA的克隆及序列分析

曹 慧，刘春香，姜倩倩，张淑芝，许瑞瑞

（潍坊学院 山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东 潍坊 261061）

天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（aspartatespecific cysteinyl proteinase，Caspase）家族是执行细胞凋亡的一类重要蛋白酶［1］，广泛参与植物的各种生理过程。在植物正常发育阶段半胱氨酸蛋白酶mRNA低水平表达，在低温、盐和干旱等环境胁迫条件下，半胱氨酸蛋白酶 mRNA表达量升高［2－3］。在植物发育阶段的细胞程序化死亡过程中以及衰老期的植物器官中［4］，半胱氨酸蛋白酶mRNA含量也会增加，显示植物的细胞程序化死亡与半胱氨酸蛋白酶有关［5］。

植物细胞程序化死亡的研究对于揭示高等植物生长发育及与环境相互作用机制和指导育种实践等方面有着重要而广泛的意义，Caspase基因作为执行细胞凋亡的一类重要蛋白酶已成为分子生物学研究的热点之一。与医学和动物Caspase基因的研究相比，植物Caspase基因研究仍处于起步阶段。目前只从少数植物中克隆了编码该酶的基因，例如山杏［6］、葡萄［7］、猕猴桃［8］等。本试验以苹果属植物八棱海棠为试验材料，采用RT－PCR、巢式PCR、3’RACE、5’RACE技术克隆到了八棱海棠Caspase基因cDNA序列，并对其进行了序列分析，为进一步研究其活性和表达的变化，以及进一步探究八棱海棠在环境胁迫条件下的适应能力提供理论依据。

1 材料与方法

供试材料为抗旱性较强的八棱海棠（MalusrobustaRehd.）。精选种子，4℃冰箱层积处理。发芽后种子植入花盆，待长出4到6片真叶时进行营养液水培，水培1周后用含有20%PEG6000的营养液（－0.63MPa）进行中度干旱胁迫 24h，提取叶片RNA。AMV反转录酶、3’－Full RACE Core Set、pMD20－T Vector、Taq酶均为 TaKaRa公司产品，JM109为本实验室保存。

参照美国国立生物技术信息中心（NCBI）上已发表的Caspase基因分析其保守序列，设计两条特异性引物F0：5’－TGGAAAGAAGAAGGCATAGTGA－3’和 R0：5’－GCAAGCACCGTCTACTCCAA－3’，用 于 RT－PCR扩增。根据RT－PCR扩增产物的测序结果设计3’RACE上游两条嵌套引物 F0： 5’－TGGAAAGAAGAAGGCATAGTGA－3’和 F1：5’－TTGGAAAGCAAATCTCCCTCT－3；设 计 R1：5’－GCAGCCGTTGTTGTTGAAAT－3’和 R2：5’－GCTCCAGTGGTGCTGAATGT－3’两条嵌套引物。3’RACE 参照TaKaRa公司的3’RACE试剂盒说明书进行。PCR扩增条件为：94℃、3min，1个循环；94℃、30s，55℃、30s，72℃、1min，30个循环；72 ℃、10min；4 ℃保存。5’RACE参照TaKaRa公司的5’RACE试剂盒说明书进行，PCR扩增条件为：94℃、3min，1个循环；94℃、30s，60℃、30s，72℃、2min，30个循环；72℃、10min；4℃保存。PCR法鉴定的阳性克隆由山东省农业科学院高新技术研究中心测序部进行序列测定。测序结果用DNA man软件进行氨基酸多重序列比对分析，利用SignalP（www.psort.com）对其氨基酸进行信号肽分析。

2 结果与分析

2.1 八棱海棠类Caspase基因cDNA的RT－PCR扩增

以八棱海棠总RNA反转录的单链cDNA为模板，利用一对特异引物F0和R0进行PCR扩增，扩增出了一条约280bp的条带（见图1）。蓝白斑筛选后，对阳性重组质粒进行双向测序，测序结果显示重组质粒PCR产物与目的片段大小相符。

图1 八棱海棠类Caspase基因特异序列RT－PCR分析

2.2 八棱海棠类Caspase基因cDNA的3’RACE和5’RACE扩增

根据RT－PCR产物测序结果设计的2条正向嵌套引物F0和F1分别用于3’端第1轮和第2轮PCR扩增。3’RACE首轮扩增没有明显的特异条带出现，以首轮PCR反应液为模板，用内侧引物对首轮扩增产物进行巢式PCR扩增，得到1条约846bp的特异条带（见图2（a））。分别用引物5’RACE Outer Primer、R1和5’RACE Inner Primer、R2进行5’RACE 首轮和巢式PCR扩增。5’RACE首轮也没有扩增出明显的特异条带，第2轮扩增出1条约627bp的特异条带（见图2（b））。对3’RACE 与5’RACE阳性重组质粒进行双向测序，结果显示重组质粒测序片段大小分别与目的片段大小相同，表明目的片段已克隆成功。

图2 3’RACE和5’RACE PCR 扩增

2.3 八棱海棠类Caspase基因cDNA全长序列分析

RT－PCR和3’RACE、5’RACE巢式PCR扩增产物的阳性克隆并经过双向测序，RT－PCR获得了276 bp的片段，3’RACE巢式PCR扩增产物为846bp，5’RACE巢式PCR扩增产物为627bp。将3段序列拼接，获得的八棱海棠Caspase基因cDNA全长1 429 bp（见图3）。序列测序结果显示5’端的起始密码子ATG前有一段非编码区，而3’末端有一段polyA多聚核苷酸结构，说明了序列的完整性，符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。

经BLAST分析，八棱海棠Caspase基因cDNA与山杏Caspase基因mRNA序列的同源性高达86%；与葡萄、猕猴桃（XM＿002278588.2）同源性为82%。

2.4 八棱海棠类Caspase基因推测的氨基酸序列分析

利用DNA man软件分析发现，该cDNA序列开放阅读框（ORF）为1 077bp，编码358个氨基酸，预测其分子量为38.78ku（见图4）。

图3 八棱海棠类Caspase基因cDNA序列

图4 八棱海棠类Caspase基因推测的氨基酸序列

利用SignalP（www.Psort.com）对其氨基酸进行信号肽分析，结果见图5，发现N端有一个23个氨基酸的信号肽，切割点在第23位Ala和第24位Ala氨基酸之间。信号肽序列为MARLTLFLSAALALAAISCVAAA。

图5 八棱海棠类Caspase氨基酸序列信号肽分析

通过Blast对比，将与八棱海棠类Caspase基因同源性较高的基因序列一起构建进化树分析，结果见图6，可知八棱海棠与山杏（U93166.1）在该基因座位上亲缘关系最近，属于一个分支。

图6 八棱海棠类Caspase序列与GenBank中序列同源性比较

3 讨论

Caspase家族蛋白酶经过一系列的级联反应，通过不同的信号途径参与多种类型的细胞凋亡［9］。近年来，随着医学和动物中Caspase基因研究取得长足进展，植物细胞的程序性死亡也受到广泛关注，Caspase基因作为其中的关键酶，已成为植物逆境胁迫研究领域的一个热点［10－14］。

作为直接导致PCD过程中细胞原生质解体的蛋白酶系统，Caspase控制着PCD的信号传导和实施过程［15］，现已从山杏、葡萄、猕猴桃等植物中克隆了编码该酶的基因。尽管对于半胱氨酸蛋白酶如何被生长发育或外部刺激信号激活，以及其如何参与调控细胞死亡的具体过程还不清楚，但Caspase家族成员在空间结构上具有相似，并且在氨基酸序列上具有同源性。

本研究通过干旱胁迫诱导苹果属植物八棱海棠发生PCD，提取叶片总RNA进行RT－PCR，获得同源验证序列，再利用巢式PCR技术从八棱海棠成功分离出类半胱氨酸蛋白酶基因cDNA 1 429bp的全长序列。序列分析表明，Caspase基因cDNA序列编码358个氨基酸，N端含有1个23个氨基酸的信号肽，第23位与第24位之间存在Ala切割位点，预示这个位点可能与此蛋白酶折叠、分泌过程有关［16－17］。与 GeneBank中其他半胱氨酸蛋白酶基因的同源性为78%～86%，分析表明这个新基因与山杏亲缘关系最近，属于同一半胱氨酸蛋白酶分支。

天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族是执行细胞凋亡的一类重要蛋白酶，广泛参与植物的各种生理过程。本研究首次从八棱海棠中克隆得到类半胱氨酸蛋白酶基因，为探索应用半胱氨酸蛋白酶分子培育抗性苹果属植物提供了目标基因，也为进一步发展基于Caspase基因家族的基因工程提供了新的靶标。

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