臭鳜鱼中优良乳酸菌的分离筛选与鉴定

罗靓芷，武俊瑞，刘佳艺，李欣，岳喜庆

(沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳，110866)

臭鳜鱼由鳜鱼腌制而成，气味特别，且保留了鳜鱼的本味原汁，肉质醇厚，是我国独具风味的传统水产制品。因为水产制品生产的集中、季节性及原料的易腐性，采用腌制这种传统加工方法，不仅保存了水产品丰富的营养价值，而且产生了独特的口感和风味。将腌制水产制品中的优势微生物分离筛选出来，应用于腌制水产制品的加工中，可缩短腌制水产制品的生产周期，提高产品质量与品质，因此，对腌制水产制品中优势微生物的研究非常有必要。

乳酸菌能赋予腌制水产制品柔和的酸味和香气，改善产品风味［1］，促进发酵的成熟［2］，提高制品的营养价值和功能性。从传统水产制品中筛选优势乳酸菌的研究国内外已有很多，近年来，国内外学者自传统发酵鱼制品［3］、北海淡口腌制金丝鱼［4］、醉鱼［5］、湘西传统酸鱼［6］、fish-nukazuke［7］、som-fak［8］，pleasom［9］和 Plasom［10］等中分离出乳酸菌，符合水产品发酵的生产要求。

本实验以具传统特色的臭鳜鱼为原料，依据肉制品发酵剂的筛选标准［11］，从中分离筛选鉴定优良的乳酸菌菌株以及16S rDNA序列分析等实验与研究，以期得到适合生产发酵鱼肉制品的优良菌株，为开发新型臭鳜鱼制品奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

臭鳜鱼，购于安徽黄山市与沈阳市徽菜馆。

1.2 主要培养基与试剂

MRS 培养基［12－13］;筛选培养基［14］;糖发酵细菌生化鉴定管，杭州天和微生物试剂有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)，天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 仪器设备

电热手提式高压杀菌锅，上海医用核子仪器厂;XS-212生物显微镜，南京江南永新光学有限公司;CR-21G冷冻离心机，日本HITACHI日立;PHS-25型pH计，上海雷磁仪器厂;SP-2100UV型紫外分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司;DNA扩增仪，美国BIO-RAO。

2 试验方法

2.1 菌株的分离培养

无菌操作，依据GB/T9695.19－2008，称取臭鳜鱼样品10.0 g，用灭菌剪剪碎后加入装有90 mL无菌水和一定数量玻璃珠的三角瓶中，振动摇晃30 min，以此作为稀释度为10－1的样品液。用无菌水做梯度稀释。无菌吸取1 mL适宜浓度稀释液至培养皿中，倒入适量含有2%的CaCO3的MRS固体培养基覆盖稀释液，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，37℃培养48 h。

肉眼观察，选取分布较好的平板，挑取分离较好的有代表性的单独菌落，经多次划线分离直至获得纯菌落。将纯化后的疑似菌落培养物接种于MRS斜面培养基上，37℃分别培养24 h后，置于4℃冰箱内保藏待用。

2.2 菌株的形态学观察

观察平板上疑似菌落的形态、大小、色泽等。

挑取疑似菌落培养物涂片，进行革兰氏染色试验和过氧化氢酶检验，于×100倍油镜下观察细菌的染色结果和疑似菌株的形态。

2.3 优势乳酸菌的筛选与生理生化特征的鉴定

根据肉制品发酵剂的筛选标准［11］进行产黏性试验、耐盐性试验、耐亚硝酸盐试验、耐酸性试验、葡萄糖产气试验、产H2O2试验、产H2S试验、石蕊牛奶酸凝试验、产氨试验、硝酸盐还原试验、M.R试验、V.P试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、耐高低温试验(15℃、45℃)、运动性试验、糖醇发酵试验。

2.4 菌株的生长曲线和产酸能力试验

将鉴定出的菌株分别接种于MRS液体培养基，37℃培养24 h。每4 h测1次。用可见光分光光度计于640 nm下，测定菌液的吸光度值。pH值用pH计测定。

2.5 菌株的耐温性试验

不同菌株接种于其液体培养基中，分别置于15，20，25，30，35，40，45 ℃培养箱中培养 24 h，以不接种的液体培养基为空白对照，在640 nm条件下测底OD值。

2.6 16S rDNA序列分析

2.6.1 菌株DNA的提取

将筛选出菌株接种于MRS液体培养基中，37℃培养24 h，采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.6.2 16S rDNA基因序列PCR扩增及序列分析

16S rDNA扩增引物:应用细菌通用引物，正向引物 27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1942R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。

PCR扩增反应体系(50 μL):正向引物27F和反向引物 1942R 各 1.5 μL，dNTP(10 mmol/L)1.0 μL，10 × Buffer(2.5 mmol/L Mg2+)5.0 μL，ddH2O 39.0 μL，基因组 DNA 1.0 μL，Taq 聚合酶(5 u/μL)1.0 μL。

PCR阴性对照基因组DNA采用超纯无菌水代替。

PCR扩增反应程序:95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min 30 s，经45次循环，72 ℃终延伸 7 min［15－18］。

PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，送交北京擎科新业生物公司进行测序，测得的序列与NCBI数据库已知序列进行比对及同源性分析，应用MEGA5.0软件的邻位相连(Neighbor-joining)法分析所测序列与GenBank中模式菌株16S rDNA序列，构建系统发育树。

3 结果与分析

3.1 菌株形态学鉴定结果

采用MRS固体培养基，从臭鳜鱼中分离出50株菌株，观察菌落溶钙圈、革兰氏染色及过氧化氢酶试验结果，得到能产生溶钙圈、革兰氏染色呈阳性、过氧化氢酶呈阴性的疑似乳酸菌11株，具体特征见表1。

表1 菌株形态学鉴定结果Table 1 Results of the morphological identification

根据表1的鉴定结果，所有的菌株都是呈乳白色、且菌落隆起表面光滑。分离纯化得到的所有11株疑似乳酸菌有短杆状、球状，排列方式也不尽相同。

3.2 优势乳酸菌的筛选与生理生化特征的鉴定

将分离纯化得到的11株进行生理生化特征的鉴定试验，结果如表2所示。

根据表2的生理生化鉴定结果，分离所获得菌株11株菌中，只有 L4、L12、L20、L36符合肉制品发酵菌株指标的要求:不产黏液、能耐受6 g/dL NaCl;在pH 4.5和250 mg/dL NaNO2条件下正常生长;发酵葡萄糖不产气;水解精氨酸不产氨;有良好的硝酸盐还原能力;M.R反应阳性;V.P反应阴性;不能发生明胶液化反应;能水解淀粉;可在15℃和45℃下生长。

将筛选得到的4株菌株进行糖醇发酵试验，具体结果见表3。

根据4株菌的表型特征和生理生化特点，检索《伯杰细菌鉴定手册》［19］(第八版)、《常见细菌鉴定手册》［20］，可以初步判断L4为屎肠球菌(Enterococcus faecium)、L12为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、L20为坚强肠球菌(Enterococcus durans)、L36为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

表2 生理生化鉴定结果Table 2 Results of physiological and biochemical identification

表3 糖醇发酵试验结果Table 3 Results of glycolysis test

3.3 菌株生长曲线

将筛选得到的4株优良乳酸菌接种于MRS液体培养基中培养，分析生长情况，见图1。

图1 乳酸菌生长曲线Fig.1 Growth curves of four lactic acid bacteria isolates

如图1所示，L4在4～8 h生长速度明显高于其他菌株［21］，在8～12 h时左右达到菌体密度最大值，之后进入稳定生长期，Herranz等人发现1株肠球菌在12 h时达到菌株密度最大值［22］，与之相符。其他菌株在培养到8～16 h生长速度明显加快，培养到16 h后进入到稳定生长期。从图1可以看出，筛选得出的4株菌均具备较强的生长能力。

3.4 菌株的产酸能力试验

将筛选出的4株乳酸菌接种于MRS液体培养基中培养，分析其产酸能力，见图2。

图2 24 h内乳酸菌产酸能力Fig.2 Acid-producing capacities of four lactic bacteria isolates

如图2所示，随着培养时间的延长，4株菌株培养液的pH值均呈下降趋势，培养初期pH值随时间的变化不断下降，培养16 h后，菌株培养液的pH值下降缓慢，与菌株的生长曲线大体一致。培养至24 h时，菌株培养液pH值可达到4.40以下。结合生长曲线与产酸能力，在臭鳜鱼加工过程中，发酵初期肠球菌能迅速繁殖，产生乳酸，快速降低环境体系中pH值，为发酵与其他乳酸菌生长创造良好的条件。

3.5 菌株耐温性试验

将乳酸菌菌株接种于MRS液体培养基中，在不同温度下培养，分析其耐温性，见图3。

图3 乳酸菌在不同温度下的生长情况Fig.3 Growing states of four lactic acid bacteria isolates at different temperatures

如图3所示，4株菌在15～45℃下都能生长，在25～40℃下生长情况基本良好;45℃时肠球菌的生长情况相对于乳杆菌好。说明4株菌在25～40℃适宜生长。以目前臭鳜鱼的传统发酵工艺，发酵温度为25～30℃，筛选出的4株菌能在此范围良好生长。

3.6 菌株16s rDNA分析及系统发育树的构建

3.6.1 菌株基因组DNA提取

利用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)提取菌株的基因组DNA，并采用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，得到的检测电泳图只有1个条带，如图4所示，可进行16S rDNA基因序列PCR扩增。

图4 菌株基因组DNA检测电泳图Fig.4 Electrophoretograms of DNA from four lactic acid bacteria isolates

3.6.2 16S rDNA基因序列PCR扩增

将菌株的基因组DNA进行16S rDNA基因序列PCR扩增，同时进行PCR阴性对照试验，扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图5所示，PCR阴性对照无条带，各菌株PCR产物条带单一，在1 500bp处有特异性条带，满足测序的要求。

3.6.3 16S rDNA同源性分析及系统发育树的建立

图5 菌株PCR扩增凝胶电泳图Fig.5 Electrophoretograms of PCR-amplification of 16S rDNA from four lactic acid bacteria isolates

利 用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，将所测定的4株菌株的16S rDNA序列，与GenBank/EMBL/DDBJ数据库中已知细菌的16S rDNA/rRNA序列进行比较鉴定，寻找与目的基因序列同源性最高的已知分类地位的菌种。得到菌株L4的16S rDNA序列与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株 L12的16S rDNA序列与弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株L20的16S rDNA序列与坚强肠球菌(Enterococcus durans)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高;菌株 L36的16S rDNA序列与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的16S rDNA/rRNA序列同源性最高。

从GenBank/EMBL/DDBJ数据库中，提取已知的标准菌株的16S rRNA/DNA基因序列，利用MEGA5.0软件构建系统发育树，获得目的菌的分类地位或它的系统发育地位。如图6所示，菌株L4与屎肠球菌(Enterococcus faecium)的系统位置最接近，菌株L20与坚强肠球菌(Enterococcus durans)的系统位置最接近;菌株L12与弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)的系统位置最近;菌株L36与干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)的系统位置最接近。

图6 优良乳酸菌L4、L12、L20、L36的系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of four lactic acid bacteria isolates

根据16S rDNA同源性对比结果和系统发育树，菌株L4鉴定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，L12鉴定为弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)，L20鉴定为坚强肠球菌(Enterococcus durans)，L36鉴定为干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)。

4 结论

(1)依据肉制品发酵剂的筛选标准，本文通过对臭鳜鱼中菌株的耐盐、耐酸、耐亚硝酸盐、产酸能力、生产曲线和耐温性等一系列指标的研究，筛选出4株菌都符合肉制品发酵剂的标准，具有良好的生长性能和NaCl耐受性。

(2)经过生理生化鉴定与16S rDNA序列测定分析，鉴定L4为屎肠球菌，L12为弯曲乳杆菌，L20为坚强肠球菌，L36为干酪乳杆菌。为进一步探讨乳酸菌在水产制品中的应用提供依据。

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