绿色木霉(Trichoderma virens)T43对沙棘干缩病的抑制效果及其抑菌机理

焦喜来 尹大川 Ilan Chet 邓 勋 宋瑞清*

(1.黑龙江丰林国家级自然保护区管理局，黑龙江 伊春 153033；2.东北林业大学 林学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.以色列耶路撒冷希伯莱大学 农学院)

沙棘(Hippophaerhamnoides)是多年生的灌木或小乔木，具有极强的生态适应性，对于防风、固沙、防止水土流失、治理生态环境方面具有重要意义[1]。沙棘干缩病是世界范围内危害沙棘最严重的毁灭性病害，是所有沙棘栽培区都可能出现的危险性病害。研究发现引起沙棘干缩病的病原菌为拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichoides)[2～3]，沙棘干缩病的发生、蔓延是目前困扰沙棘产业化发展的重要因素。此病造成提前落叶，常常较健康树木提早30d以上落叶，造成树势早衰、有效寿命缩短，连续发病3～4年可致死亡，果实品质下降，产量损失达40%以上，对沙棘危害极大[4]。

木霉菌(Trichodermaspp.)是拮抗微生物，具有抗菌谱广、适应性强和多机制性的特点。对多种病原菌有抑制作用。此外还具有重寄生作用，通过胞外酶破坏病原菌细胞壁，削弱病原菌的生长势，甚至杀死病原菌。目前世界范围内已有以木霉菌为主要成分的生物杀菌剂，在农林业生产中发挥重要作用[5～6]。同时，木霉菌对植物还具有促生抗逆的作用，通过定殖和次生代谢产物促进植物生长，提高其抗病能力[6]。本研究选用自以色列引进的木霉菌株T43及其次生代谢产物，研究其对沙棘干缩病病原菌的抑制效果和抑菌机理，为进一步有效控制沙棘干缩病打下基础。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

实验所用木霉菌株T43和拟枝孢镰孢菌(F.sporotrichoides)由东北林业大学林学院林木病理教研室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株T43对拟枝孢镰孢菌的拮抗效果

采用平板对峙培养法。在直径90mm的PDA平板上，相距50mm分别接入直径10mm、培养5d的木霉菌株和病原菌株的菌片。以在平板中心接种直径10mm的各菌株菌片作为对照。每处理3个重复，置于25℃恒温培养箱中培养。4d后用十字交叉法测量菌落的趋向半径，计算抑制率、相对抑制效果和拮抗系数。

被抑制率={[(单独培养菌落半径)-(菌落趋向半径)]/(单独培养菌落半径)}×100%

相对抑制效果=病原菌被抑制率/拮抗菌被抑制率

1.2.2 菌株T43非挥发性代谢产物对拟枝孢镰孢菌的抑制作用

预实验结果表明，乙酸乙酯作为萃取剂获得的提取物抑菌效果较高，适宜的萃取比例为发酵液∶乙酸乙酯=1∶3(V/V)。因此该研究采用乙酸乙酯作为萃取剂，对T43发酵液进行萃取，以获得非挥发性代谢产物，即乙酸乙酯提取物。

木霉菌株发酵液的制备：用直径10mm打孔器切取培养好的木霉菌株菌落，分别接入盛有300mL PD培养基的三角瓶(500mL)中，每瓶接种4片，置于摇床(25℃、120r/min)上培养5d，获得发酵液。无菌纱布过滤后，取滤液备用。

乙酸乙酯提取物的制备：乙酸乙酯与滤液按1∶3(V/V)的比例混合，常温静置2d，分液去除无机相后，低压旋转蒸发去除有机溶剂，将所得固体样品用5mL 10%的吐温80溶解，除菌过滤，即得乙酸乙酯提取物样品。

抑菌活性检测：采用混合培养基法。将5mL乙酸乙酯提取物与500mL PDA培养基均匀混合，制成平板，中央接种直径为10mm的病原菌株菌片，置于25℃的恒温培养箱中培养4d，测量菌落直径大小(十字交叉)。以含10%吐温80的无菌水作对照，每个处理3个重复。根据以下公式计算抑菌率。

抑菌率=[(对照净生长量-处理净生长量)/对照净生长量]×100%

1.2.3 木霉菌株T43发酵液提取物对病原菌抗氧化保护酶的影响

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)是植物体中典型的抗氧化保护酶，所以本研究选择这三种酶进行抑菌机理的初步探究。

无菌条件下切取病原菌株平板培养菌落，用无菌水冲洗2～3次，吸干水分。室温下，将菌片分别用菌株T43发酵液提取物浸泡2h、4h、6h、8h、10h、12h和24h，以无菌水浸泡菌片作为对照。

(1)SOD粗酶液制备：称取不同处理时间的病原菌菌片1g，按1∶10(W/V)加入10mL 50mmol PL、pH7.8的冷磷酸缓冲液，冰浴研磨，冷冻离心(4℃，10 000rpm)20min。取上清液[7]。单位定义：每克菌丝体在1mL反应液中SOD 抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活力单位。

(2)CAT与POD粗酶液制备：称取不同处理时间的病原菌菌片1g，按1∶10(W/V)加入10mL 50mmol PL、pH7.0的冷磷酸缓冲液，冰浴研磨，冷冻离心(4℃，10 000rpm)20min。取上清液[8]。

3种酶的活性测定使用南京建成公司生产的试剂盒。

2 结果与分析

2.1 菌株T43对拟枝孢镰孢菌的拮抗效果

对峙培养96h后，菌株T43对病原菌生长抑制率为44%，相对抑制效果为0.75，木霉菌株生长速度快，竞争系数高，在同病原菌对峙培养中，迅速占领生态位。而病原菌开始生长较快，但在与木霉接触后生长受到抑制，在木霉的抑制下几乎停止生长，并最终与木霉形成明显的拮抗线(图1)。

2.2 菌株T43乙酸乙酯提取物对拟枝孢镰孢菌的抑制效果

在培养96h后，病原菌菌落直径明显小于对照组，说明木霉菌株发酵液提取物对病原菌生长具有一定的抑制作用(图2)，其抑制率为46.10%，其菌丝也较对照组稀疏，生长较弱且生长缓慢。

2.3 菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对拟枝孢镰孢菌抗氧化保护酶的影响

菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对拟枝孢镰孢菌抗氧化保护酶均有不同程度的影响(图3～图5)。

(1)对超氧化物歧化酶(SOD)的影响：木霉菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对病原菌SOD有明显的抑制作用(图3)。经乙酸乙酯提取物处理后，病原菌SOD在4～10h出现短暂的上升之后，在10h时达到峰值，为68μg/g，在10h后直线下降，出现了明显的拐点，与对照组形成鲜明的对比。

(2)对过氧化氢酶(CAT)的影响：木霉菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对病原菌CAT有明显的抑制作用(图4)。经乙酸乙酯提取物处理后，病原菌CAT在4～8h出现短暂的上升之后，在8h时达到峰值，为0.049μg/g，在8h后直线下降，出现了明显的拐点，24h降到最低为0.01μg/g。对照组在达到最高后数值趋于平稳。

(3)对过氧化物酶(POD)的影响：木霉菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对病原菌POD有明显的抑制作用(图5)。经过处理后，病原菌SOD在4～10h出现短暂的上升之后，在10h时达到峰值，为6μg/g，在10h后直线下降，出现了明显的拐点，24h降到最低为2μg/g。对照组则一直上升，最后稳定在8μg/g。

3 结论

通过木霉菌株T43对沙棘干缩病菌的抑制效果及其抑菌机理的初步研究，得出以下结论：(1)木霉菌株T43对拟枝孢镰孢菌具有一定的拮抗效果；(2)菌株T43乙酸乙酯提取物中含有抑菌活性成分，抑制沙棘干缩病病原菌的生长；(3)菌株T43乙酸乙酯提取物可显著降低病原菌3种抗氧化保护酶(SOD、POD、CAT)活性，对病原菌的膜保护系统有一定的破坏作用。

参考文献：

[1]杨芳.沙棘的研究进展[J].第一军医大学分校学报，2004，27(1):79～81.

[2]宋瑞清，孙海珍，等.黑龙江沙棘干缩病病原菌的研究[J].林业科学，2010,46(9):88～95.

[3]宋瑞清，孙海珍，等.黑龙江省沙棘干缩病病原菌生物学特性的研究[J].林业科技，2009,34(2):20～22.

[4]杜汉君.沙棘干缩病发病规律及成因的调查与分析[J].沙棘，2001，14(1):13～15.

[5]Lewis J A , Papavizas G C. Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp. in liquid and solid growth media[J].Soil Biol. Biochem,1983,(15):3512357.

[6]Lewis J A , Papavizas G C. Chlamydospore formation by Trichoderma spp. innatural subst rates[J].Can J. Microbiol,1984,(30):127.

[7]邓龙,邓勋,尹大川，等.引进木霉菌株T-43对樟子松枯梢病菌的抑制效果[J].黑龙江生态工程职业学院学报,2012,25(3):38～39.

[8]张芹.松针褐斑病菌(Lecanostictaacicola)毒素致病作用的细胞学研究[D].南京:南京林业大学学位论文,2003.