Plk1磷酸化修饰PinX1对宫颈癌HeLa细胞有丝分裂及凋亡的影响*

王 冲，余 建，黄 河#

1) 郑州大学第一附属医院血液科 郑州 450052 2) 浙江大学附属第一医院骨髓移植中心 杭州 310003

PinX1最初是作为一个新的端粒结合蛋白(telomeric repeat binding protein,TRF)，由Zhou等[1]在2001年以酵母双杂交的方法首先鉴定出来。PinX1由328个氨基酸组成，其中有2个特殊的结构域：经常出现在RNA结合蛋白中的G-patch结构域和端粒酶抑制结构域。PinX1是迄今发现的对端粒酶活性具有最强抑制作用的蛋白质，抑制PinX1的功能则会促进端粒酶活性进而延长端粒。作者的前期研究[2]发现：有丝分裂前期，PinX1定位于染色体周边以及动点外层；而在有丝分裂期，siRNA抑制PinX1蛋白的表达导致染色体滞后出现[2]。但PinX1通过何种机制参与细胞周期的调控尚不清楚。作者运用酵母双杂交、免疫共沉淀、谷胱甘肽-S转移酶(glutathione S-transferase，GST)沉降实验以及流式细胞术、免疫荧光染色分析等方法，初步探讨有丝分裂激酶Plk1磷酸化修饰PinX1对细胞有丝分裂及凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂人胚肾293T细胞株及人宫颈癌HeLa细胞株由浙江大学血液分子生物学实验室保存；胎牛血清购自Hyclone公司；青、链霉素和DMEM培养基购自Invitrogen公司；胰蛋白酶购自华美(SABC)公司；Nocodazole、GW843683X、G418购自Sigma公司。

质粒：含有Flag标记的PinX1真核表达质粒由哈佛大学Kunping Lu教授惠赠。BD-PinX1、Flag-PinX1、GST-PinX1、GFP-PinX1及GST-PinX1截短突变质粒均通过PCR扩增PinX1片段，分别插入pGBKT7、p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pEGFP-C2、pGEX-5X-3质粒载体构建而成；Flag-Plk1、GST-Plk1、AD-Plk1质粒通过PCR扩增的Plk1片段插入p3XFLAG-myc-CMVTM-24、pGEX-5X-3、pGADT7质粒构建而成。所有质粒均经测序证实。

抗体：鼠抗Myc单克隆抗体9B11、鼠抗GFP单克隆抗体、鼠抗HA单克隆抗体购自Cell Signaling公司；鼠抗Flag单克隆抗体M2、鼠抗α-tubulin单克隆抗体购自Sigma-Aldrich公司；鼠抗PinX1单克隆抗体购自Abnova公司；鼠抗Plk1单克隆抗体、鼠抗磷酸化丝氨酸单克隆抗体购自Abcam公司；罗丹明偶联羊抗鼠IgG抗体购自Jackson Immunoresearch公司。

其他材料：AH109酵母菌种、DH5α及BL21大肠杆菌菌种由浙江大学血液分子生物学实验室保存；人睾丸cDNA文库、casein蛋白和MatchmakerTMGAL4 Two-Hybrid System 3试剂盒购自Clontech公司；限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ、T4 DNA连接酶及相关缓冲液购自TaKaRa公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.2Plk1与PinX1结合的检测

1.2.1 酵母双杂交实验 按照Clontech公司酵母双杂交操作手册进行。酵母双杂交实验共分为4组进行，阴性对照组(pGBKT7-Lam+pGADT7-T)，阳性对照组(pGBKT7-P53+pGADT7-T)，实验组(pGBKT7-PinX1+pGADT7-Plk1)，已知阳性结果组(pGBKT7-TRF1+pGADT7-Plk1),分别将上述各组的质粒共转染进入AH109感受态酵母菌，涂于SD/-Trp/-Leu及SDP/-Ade/-Trp/-His，30 ℃培养至阳性菌落出现，再将菌落划线至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal培养板培养至蓝色菌落出现。

1.2.2 重组载体转染细胞 转染方法参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行操作。将HeLa细胞株培养至对数生长期，转染前24 h，胰酶消化细胞并接种于6孔板，每孔5×105个细胞，取相应真核表达质粒及其空白对照质粒转染细胞。

1.2.3 免疫共沉淀实验 收集HeLa细胞，加入RIPA缓冲液进行裂解；将细胞裂解液或正常鼠血清(对照)与蛋白A和蛋白G琼脂凝胶珠共孵育后，加入1 μg鼠抗PinX1单克隆抗体，旋转摇床上4 ℃旋转过夜孵育以捕获目的蛋白。蛋白裂解物及免疫沉淀复合物用上样缓冲液加热变性，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转移至硝酸纤维素膜上，以相关抗体检测蛋白，再以相应第二抗体孵育后，用ECL发光底物压片显影。

1.2.4 GST融合蛋白纯化 参照GST结合蛋白纯化说明书进行操作。纯化出的谷胱甘肽琼脂糖珠融合蛋白质行SDS-PAGE电泳，以考马斯亮蓝R-250染色检验，将纯化的蛋白质4 ℃保存。

1.2.5 GST体外沉降实验 共分为3组进行检测，内参对照组，GST对照蛋白组和GST-PinX1融合蛋白组。HeLa细胞裂解液经RIPA缓冲液预清除后，首先取20 μL裂解液作为内参对照，再分别与GST对照蛋白和GST-PinX1融合蛋白共同孵育，随后以SDS-PAGE电泳分离产物后，进行免疫印迹分析。

1.3Plk1体内外磷酸化修饰PinX1实验

1.3.1 体外磷酸化实验 分为4组进行检测，casein阳性对照组，GST对照蛋白组，GST-PinX1融合蛋白组，GST-PinX1 5A突变体融合蛋白组。分别在各组蛋白中加入10×磷酸化buffer 3 μL，2 pmol/L的ATP 1 μL，Plk1蛋白激酶1 μL，γ-32P-ATP 0.5 μL，目的蛋白2 μg，加水补足到30 μL，30 ℃水浴45 min。反应结束后，加入20 μL PBS 和4 μL 6×SDS加样缓冲液，行SDS-PAGE电泳，以考马斯亮蓝R-250染色，制作干胶后进行放射自显影。

1.3.2 体内磷酸化实验 将Flag-PinX1真核表达质粒转染293T细胞，以100 nmol/L Nocodazole处理18 h，收集细胞前，再分别加入1 μmol/L DMSO(对照组)或者Plk1特异性小分子抑制剂GW843682X(实验组)处理8 h，收集细胞进行免疫共沉淀实验。

1.4Plk1磷酸化PinX1对细胞有丝分裂影响的检测采用免疫荧光染色分析。以相应真核表达质粒(GFP-PinX1、GFP-PinX1 5A及GFP-PinX1 5D)转染HeLa细胞24 h后，用甲醛溶液固定细胞，TBST缓冲液室温下封闭30 min。用一抗和二抗室温下孵育1 h，TBST缓冲液清洗后，以适量DAPI染色细胞，滴加抗淬灭剂并封片。用Zeiss Axiovert 200荧光倒置显微镜进行免疫荧光染色检测。

1.5Plk1磷酸化PinX1对细胞凋亡的影响分别收集转染GFP、GFP-PinX1、GFP-PinX1 5A和GFP-PinX1 5D质粒的HeLa细胞，4 ℃条件下用体积分数为70%的冰乙醇固定30 min，15 000 r/min离心30 s。细胞重悬于PBS中，以碘化丙啶4 ℃避光染色1 h，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.6统计学处理采用SPSS 17.0 进行数据分析。转染不同质粒的HeLa细胞凋亡率的比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1Plk1与PinX1结合情况

2.1.1 酵母双杂交结果 共转pGADT7-Plk1与pGBKT7-PinX1的AH109菌株在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-a-gal培养板能够生长并激活报告基因(图1)，表明Plk1可能是一个新的PinX1结合蛋白。

2.1.2 免疫共沉淀结果 在HeLa细胞株中，内源性Plk1能够与PinX1抗体发生共沉淀反应，形成复合物，而与对照血清无结合(图2)，表明Plk1与PinX1可能在细胞内相互结合。

2.1.3 GST沉降实验结果 GST-PinX1能够与内源性Plk1相结合，形成复合物，而空GST蛋白则不能将Plk1沉淀下来(图3)，提示PinX1与Plk1能够在体外相互结合。

图1 Plk1与PinX1结合的酵母双杂交结果

图2 Plk1与PinX1结合的免疫共沉淀结果

图3 GST沉降实验结果

2.2Plk1体内外磷酸化修饰PinX1情况

2.2.1 体外磷酸化实验结果 Plk1能够在体外磷酸化GST-PinX1，而不能磷酸化GST-PinX1 5A以及GST对照蛋白(图4)。

2.2.2 体内磷酸化实验结果 加入GW843682X处理后，磷酸化PinX1条带明显减弱(图5)。表明Plk1能够在体内磷酸化修饰PinX1。

2.3Plk1磷酸化PinX1对细胞有丝分裂的影响

免疫荧光染色分析结果显示过量表达PinX1非磷酸化突变体会导致明显的染色体排列异常，而过量表达PinX1野生型及模拟磷酸化突变体则不明显(图6)。

图4 Plk1体外磷酸化修饰PinX1情况

图5 Plk1体内磷酸化修饰PinX1情况

图6 Plk1磷酸化PinX1对细胞染色体的影响

2.4Plk1磷酸化修饰PinX1对HeLa细胞凋亡的影响转染了GFP、GFP-PinX1、GFP-PinX1 5A及GFP-PinX1 5D的HeLa细胞的凋亡率分别为(4.63±0.25)%、(8.00±0.70)%、(45.30±1.45)%和(8.83±0.45)%，4者比较差异有统计学意义(F=76 554.133,P<0.001)。表达PinX1非磷酸化突变体的HeLa细胞的凋亡明显增加。

3 讨论

端粒酶在肿瘤细胞永生化过程中起到重要作用[3]。端粒酶活性受到多种蛋白质的调控，这些蛋白质通过相互作用影响端粒酶全酶的组装和去组装，使其空间构象发生改变，或使其与端粒序列的结合能力改变，从而影响端粒酶的功能或直接抑制端粒酶活性[4-5]。PinX1是一个经典的端粒相关蛋白质，除了能够与端粒结合蛋白TRF1相互作用之外，还能与hTERT和hTR在体内形成复合物[6]。PinX1还是迄今发现的对端粒酶活性具有最强抑制作用的蛋白质。外源性PinX1过量表达能强力抑制端粒酶活性，从而导致端粒缩短；而当敲除内源性PinX1后，端粒酶活性升高，端粒长度增加。除了在端粒长度调控方面发挥重要功能之外，已有研究[7]表明：PinX1在实体肿瘤中的表达与肿瘤进展及预后高度相关[7]；在裸鼠中，PinX1的缺失有促进肿瘤发生的作用[8-9]。近来亦有报道[2,10]表明PinX1也可能参与了细胞周期的调控。因此，PinX1有可能是一个潜在的联系端粒和细胞有丝分裂的信号分子，也是一个很有希望的抗肿瘤药作用靶点。

在该项研究中，作者采用酵母双杂交的方法，成功鉴定出Plk1是一个新的PinX1结合蛋白。Plk1能够与PinX1在体内体外相互结合，Plk1能够在有丝分裂期磷酸化修饰PinX1。免疫荧光染色结果显示：PinX1的非磷酸化突变体能够导致细胞出现大量异常排列染色体，而野生型和模拟磷酸化突变体则没有此等表现。这充分说明，Plk1对PinX1的磷酸化修饰对保证细胞染色体的正常分离是必需的。这些结果提示：在寻找细胞端粒和有丝分裂的功能链接点方面，PinX1有可能是一个新的突破口。同时，过量表达PinX1非磷酸化突变体会导致明显的细胞凋亡增加，表明Plk1可能通过磷酸化PinX1参与了细胞凋亡的调控，这也为进一步研究Plk1对细胞周期和凋亡调控的影响提供了新的实验证据。

综上所述，该研究证明了Plk1能够磷酸化并调控PinX1；PinX1的非磷酸化突变体能导致细胞染色体分离出现异常及细胞凋亡的增加。选择PinX1作为基因治疗的靶点，可能会为肿瘤的靶向治疗提供新的线索。

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