高效液相色谱法-蒸发光散射检测器测定碎岩散中黄芪甲苷的含量※

高 侃 魏 东 耿 惠 刘敏彦

(河北省辛集市第二医院放化疗科，河北 辛集 052360)

碎岩散是河北省辛集市第二医院自主研发的中药复方制剂，由黄芪、炮附子、肉桂、鹿角胶、熟地黄等组成，用于治疗气虚阳微型中晚期食管癌。黄芪为君药，具有补气固表、利尿排毒、敛疮生肌的功效[1]，主要含有皂苷、黄酮、多糖、氨基酸和多种微量元素[2]，其中黄芪甲苷为主要活性指标成分之一。为有效控制其质量，我们采用高效液相色谱法-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)测定碎岩散中黄芪甲苷的含量，结果如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器 高效液相色谱仪(Agilent 1100，美国Agilent公司)，配有HPLC泵(Agilent G1311A Quat Pump)，自动进样器(Agilent G1313A ALS)；柱温箱(Agilent G1316A Colcom)；脱气机(Agilent G1379A Degasser)；Alltech-2000型蒸发光散射检测器(Evaporative Light Scattering Detector，ELSD)。

1.1.2 试药 黄芪甲苷对照品(中国药品生物制品检定所)；碎岩散(河北省辛集市第二医院，批号110501)；甲醇为色谱纯(美国Fisher公司)，水为双蒸馏水，三氯甲烷、正丁醇、氢氧化钠均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液制备

1.2.1.1 供试品溶液制备 取碎岩散约4 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声提取30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液25 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣用水20 mL定量转移至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取2次，每次20 mL，弃去三氯甲烷液，水层用水饱和的正丁醇提取4次(20 mL/次)，合并正丁醇液，用0.1% 氢氧化钠(NaOH)溶液洗涤2次(10 mL/次)，再用正丁醇饱和的水洗涤2次(10 mL/次)，合并碱洗液和水洗液，用水饱和的正丁醇提取2次(10 mL/次)，与上述正丁醇液合并，置水浴上蒸干，残渣用75%甲醇定量转移至10 mL容量瓶中至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.2.1.2 黄芪甲苷对照品溶液制备 精密称取黄芪甲苷对照品适量，加甲醇制成每mL约含黄芪甲苷0.1 mg的溶液，即得。

1.2.2 色谱条件 色谱柱为 Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(75∶25)，流速为0.8 mL/min，ELSD检测漂移管温度为100 ℃，气体流速为3 L/min，分别精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10、20 μL与供试品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，用ELSD测定，以外标两点法对数方程计算黄芪甲苷含量即得。理论塔板数按黄芪甲苷峰计算应不低于4 000。

1.2.3 线性关系考察 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液(98.18 μg/mL)5、10、20、30、50 μL注入高效液相色谱仪中，进行测定。以进样量的自然对数为横坐标，峰面积积分值的自然对数为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4 精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液10 μL，分别连续进样5次，测定峰面积，测定相对标准偏差(RSD)。

1.2.5 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液，每隔4 h进样1次，进样量10 μL，测定峰面积。

1.2.6 重复性试验 取同一批碎岩散，分别称取高(5 g)、中(4 g)、低(3 g)3个剂量，每个剂量3份，按照1.2.1.1项下制备方法，分别进行超声提取，制备，注入高效液相色谱仪测定。

1.2.7 阴性试验 按照碎岩散的制备方法制成不含黄芪的模拟制剂，按照1.2.1.1项目制备方法制成阴性对照品溶液，按含量测定方法进行测定。

1.2.8 加样回收率试验 采用加样回收实验，取同一批碎岩散9份，分别加入低、中、高3个浓度的黄芪甲苷对照品溶液50 mL，按照1.2.1.1项下制备方法，进行提取，制备，测定，计算回收率。

1.2.9 耐用性试验 对不同的色谱柱、不同的柱温和漂移管温度变化时对黄芪甲苷含量的影响进行考察。

2 结 果

2.1 线性关系考察 黄芪甲苷在5～50 μL (即0.490 9～4.909 μg)范围内呈良好的线性关系，其进样量的自然对数与峰面积积分值的自然对数回归方程为：Lny=1.712 Lnx+7.106，r=0.9 998。

2.2 精密度试验 黄芪甲苷RSD为2.19%，说明仪器精密度良好。

2.3 稳定性试验 在测定的24 h内，黄芪甲苷RSD为2.23%，说明溶液在24 h内基本稳定。

2.4 重复性试验 黄芪甲苷RSD为1.67%，说明方法的重现性良好。

2.5 阴性试验 其他组分对测定无干扰，见图1、2、3。

图1 黄芪甲苷对照品色谱图

图2 阴性对照品色谱图

图3 碎岩散色谱图

2.6 加样回收率试验 黄芪甲苷的平均回收率为99.54%(n=9)，RSD为1.93%，说明方法准确度良好，见表1。

表1 加样回收率结果

2.7 耐用性试验 更换不同的色谱柱(Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；Agilent Zorbax XDB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；Phenomenon Gemini C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)测定同一份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD为2.53%；柱温发生变化(25 ℃、30 ℃、35 ℃)，测定同一份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD为2.05%；漂移管温度发生变化(75 ℃、80 ℃、85 ℃)，测定同一份供试品溶液中黄芪甲苷含量的RSD为2.22%。

3 讨 论

供试品的处理采用了甲醇超声提取、正丁醇萃取的方法，操作简便，为减少其他成分的干扰，采用碱水对正丁醇萃取液进行了处理，所得供试品图谱清晰。

黄芪甲苷为末端紫外吸收物质，采用紫外检测器200 nm左右的检测波长进行测定时，杂质对色谱峰的干扰较大，基线不平稳。而ELSD为通用型质量检测器，适合于无紫外吸收的皂苷类化合物的检测。ELSD的响应值的大小由被测化合物颗粒的数量和大小决定，而不受流动相溶剂的干扰，溶剂在漂移管中全部蒸发。该方法灵敏度高，回收率及重现性均较好，且空白无干扰，适用于碎岩散中黄芪甲苷的含量测定。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版：一部[M].北京：化学工业出版社，2010：283-284.

[2] 江燕，晁若冰.黄芪药材中黄芪甲苷和总皂苷含量的比较[J].华西药学杂志，2007，22(3)：322-324.