化痔灵片的制备与质量标准研究

蔡小玲，秦贻强，周小雅(.林医学院附属医院药学部，广西 桂林 5400;2.广西卫生职业技术学院，南宁 530023)

化痔灵片是由黄连、五倍子、槐花、三七、琥珀、苦地胆、猪胆汁膏等药材制成的片剂，具有凉血、收敛、消炎的功效［1］。用于内外痔疮，临床疗效较好，但其质量标准只有薄层色谱鉴别，没有有效成分的含量测定项目。为了保证该制剂临床效果，有效控制其质量，本实验除进行其制备工艺、薄层色谱法定性、砷盐的限量检查等研究以外，更采用高效液相色谱法(HPLC)对制剂中黄连的主要成分盐酸小檗碱的含量进行测定，为建立该制剂的质量标准提供了依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-10AT HPLC仪，威玛通用多媒体色谱数据工作站，SPD-10A紫外检测器(日本岛津公司生产)。

1.2 药品与试剂

黄连对照药材、五倍子对照药材、槐花对照药材、三七对照药材均由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为0080-9705、121078-200402、12270-200803、120941-200703。盐酸小檗碱对照品、没食子酸对照品、芦丁对照品、人参二醇对照品均由中国药品生物制品检定所提供，批号分别为110713-200208、110885-200102、100080-200306、110701-200311。猪去氧胆酸对照品由由SIGMA公司提供，批号:031K1489。化痔灵片及缺黄连的阴性对照样品由桂林兴达制药厂提供。用于薄层色谱鉴别的化痔灵片的批号分别为:20100701、20100702、20100703。用于含量测定的化痔灵片的批号分别为:20100419、20100512、20100421、20100424、20100428、20100515、20100411、20100510、20100425、20100415。乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 处方与制备

2.1 处方

黄连2.9 g，琥珀 2.9 g，苦地胆 3 g，三七 7.2 g，五倍子57 g，猪胆汁膏 1.5 g，石榴皮57 g，枯矾33 g，雄黄(水飞)12 g，槐花 6 g，乌梅(去核)5 g，诃子 6 g。

2.2 制备

以上12味中药，除猪胆汁膏外，其余黄连等11味中药粉碎成细粉，过筛，混匀，猪胆汁膏用适量沸水溶解，加入适量炼蜜，与上述细粉混和，加入淀粉适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成1000片，包糖衣，即得。

3 质量控制

3.1 性状

本品为糖衣片，除去糖衣后显褐色;味苦。

3.2 薄层色谱鉴别

3.2.1 黄连:取本品5片，除去糖衣，研细，加甲醇30 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 ml使溶解，用氨试液调节至pH值为10，用氯仿振摇提取2次，每次20 ml，合并氯仿提取液，用水洗涤2次，每次10 ml，弃去水洗液，氯仿液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄连对照药材1 g，加甲醇10 ml加热回流10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为对照药材溶液。另取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2000年版)附录Ⅵ B］试验，吸取上述3种溶液各2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-浓氨试液(12∶6∶3∶3∶1)为展开剂，置氨蒸气饱和的层析缸内，展开，取出，晾干，在紫外光灯(365 nm)下检视，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图1。

图1 黄连薄层色谱图Fig 1 TLC of Coptis Chinensis

3.2.2 五倍子:取本品5片，除去糖衣，研细，加甲醇30 ml，加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取五倍子对照药材1 g，加甲醇10 ml，同法制成对照药材溶液。另取没食子酸对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2000年版)附录Ⅵ B］试验，吸取上述3种溶液各2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸(10∶5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%三化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的相应位置上，显相同颜色的斑点，见图2。

图2 五倍子薄层色谱图Fig 2 TLC of Galla Chinensis

3.2.3 槐花:取槐花对照药材1 g，加甲醇10 ml加热回流10 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇5 ml使溶解，作为对照药材溶液。另取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2000年版)附录Ⅵ B］试验，吸取上述2种溶液各2 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点清晰，供试品色谱中，在与对照品及对照药材色谱相应的相应位置上，显相同颜色的斑点，见图3。

3.2.4 三七:取本品20片，除去糖衣，研细，加甲醇30 ml，加热回流1 h，滤过，滤液蒸至近干，残渣加7%的盐酸的50%乙醇溶液20 ml加热回流4 h，放冷，滤过，滤液加水40 ml，摇匀，加氯化钠饱和，用乙醚振摇提取3次，每次30 ml;合并乙醚提取液，用5%氢氧化钠溶液振摇提取3次，每次30 ml，碱液弃去;乙醚液用水洗至中性，加无水硫酸钠脱水，滤过，滤液蒸干，残渣加氯仿1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取三七对照药材0.2 g，加甲醇20 ml，同法制成对照药材溶液。另取人参二醇对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2000年版)附录ⅥB］试验，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯(5∶5.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材及对照品色谱相应的相应位置上，显相同颜色的斑点，见图4。

图3 槐花薄层色谱图Fig 3 TLC of Flos Sophorae

图4 三七薄层色谱图Fig 4 TLC of Panax Notoginseng

3.2.5 猪胆汁膏:取本品15片，除去糖衣，研细，加乙醚30 ml，加热回流1 h，滤过，滤液弃去，滤渣加甲醇30 ml加热回流30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加20%氢氧化钠20 ml，加热回流4 h，放冷，用盐酸调pH值为2～3，用乙醚振摇提取2次，每次30 ml;合并乙醚提取液，用水洗涤3次，每次30 ml，水洗液弃去;乙醚液蒸干，残渣加醋酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取猪去氧胆酸对照品适量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法［《中华人民共和国药典:一部》(2000年版)附录Ⅵ B］试验，吸取上述2种溶液各10 μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G薄层板上，以正已烷-醋酸乙酯-冰醋酸(6∶4∶1.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以20%硫酸乙醇溶液，置105℃加热加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，见图5。

图5 猪胆膏薄层色谱图Fig 5 TLC of Pig Gall Paste

3.3 砷盐的限量检查

取本品10片，除去糖依，研细，取约1 g，精密称取，加入稀盐酸20 ml，搅拌30 min，滤过，滤渣用稀盐酸洗涤，每次10 ml，搅拌10 min，滤过，合并滤液，置100 ml量瓶中，滤渣再用稀盐酸洗涤至洗液无色，洗液滤至量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10 ml，置100 ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取2 ml，加入盐酸5 ml与水21 ml，依法检查(《中华人民共和国药典:一部》(2000年版)附录ⅨF)，含砷量不得过万分之十。

3.4 含量测定

3.4.1 溶液的制备:(1)对照品溶液的制备:精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为2.86、19.32、35.78、52.24、68.7 μg/ml的溶液，即得对照品溶液。(2)供试品溶液的制备:取本品20片，除去糖衣，研细，混匀，取约0.5 g，精密称定，精密加入盐酸-甲醇(1∶100)溶液 50 ml，称定质量，置45℃水浴温热30 min，取出，放冷，超声45 min，取出，放冷，再称定质量，用盐酸-甲醇(1∶100)溶液补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 ml，加于中性氧化铝柱(内径1 cm，5 g，干法装柱)上，用甲醇 100 ml洗脱(20滴/min)，收集洗脱液，减压回收甲醇，残渣用甲醇溶解，转移至10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。(3)阴性对照溶液的制备:按化痔灵片的处方制备不含黄连的阴性样品，按“供试品溶液的制备”方法操作，制成阴性对照溶液，备用。

3.4.2 色谱条件:色谱柱:Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:0.05 mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH=3.0)-乙腈(74.5∶25.5);流速:1.0 ml/min;检测波长:265 nm;柱温:室温;进样量10 μl。理论板数按盐酸小檗碱峰计算，不低于4000。见图6。

图6 化痔灵片的HPLC图谱Fig 6 HPLC chromatograms of Fargelin Tablets

3.4.3 线性关系考察:精密吸取不同质量浓度的盐酸小檗碱素对照品溶液各10 μl，注入HPLC仪，记录峰面积，以对照品质量浓度为横坐标(C)，测得的峰面积为纵坐标(A)，绘制标准曲线，则回归方程为:A=4772400C+51890(r=0.9993)。结果表明，当进样量在0.0286～0.6870 μg范围时，盐酸小檗碱进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

3.4.4 精密度试验:对同一供试品溶液，连续测定6次，结果盐酸小檗碱的峰面积值的RSD=0.99%，表明仪器的精密度良好。

3.4.5 重复性试验:对同一批样品依法平行测定6份，结果盐酸小檗碱平均值为0.402 mg/g，RSD=1.06%，表明本方法的重复性较好。

3.4.6 稳定性试验:对同一份供试品溶液，每隔 0、4、8、12、16、20、24 h测定1次，共7次，结果7次测定的盐酸小檗碱含量的平均值为0.409 mg/g，RSD=1.19%，表明在24 h内供试品溶液稳定。

3.4.7 加样回收率试验:精密称定已知含量的样品5份，分别精密加入质量浓度为2.290 μg/ml的盐酸小檗碱对照品溶液50 ml，按“供试品溶液的制备”方法制备，测定，计算加样回收率，见表1。

表1 化痔灵片中盐酸小檗碱加样回收率测定结果(n=5)Tab 1 Determination results of recovery rate of berberine hydrochloride in Fargelin Tablets(n=5)

3.4.8 样品中盐酸小檗碱含量的测定:按正文拟定的含量测定方法，测定了本品10批样品中盐酸小檗碱的含量。每批样品进样2次。从本品10批样品的检测结果看，盐酸小檗碱含量在56～91.5 μg/片，考虑到中药材来源的复杂性，故将本品盐酸小檗碱的含量适当下浮，拟订为每片不得少于50 μg，见表2。

4 讨论

化痔灵片在临床实践中具有良好的疗效［2］，被收载于卫生部《中华人民共和国卫生部药品标准(中药成方制剂)》第十二册(WS3-B-2294-97)。主要由黄连、琥珀、苦地胆、三七等12味传统中药组成，有凉血，收敛，消炎的功效，有一定的抗炎镇痛的作用［3-4］，用于内外痔疮。原标准中采用薄层色谱法对处方中主要药材与成分黄连和盐酸小檗碱、五倍子和没食子酸、槐花和芦丁等成分进行定性检查。而近年来中药药材价格逐年提高，尤其是三七、猪胆汁膏等药材价格飙升，因此本实验增加三七标准药材和人参二醇对照品、猪胆汁酸和猪去氧胆酸对照品的检测，能更有效地控制产品质量，适应各医院制剂的实际情况。此外，本文采用HPLC对制剂中黄连的主要成分盐酸小檗碱进行含量测定，共测定了10批样品，拟定了化痔灵片中盐酸小檗碱的含量，能更好控制本制剂的质量。

表2 10批样品中盐酸小檗碱含量的测定结果Tab 2 Determination results of contents of berberine hydrochloride in 10 batches of Fargelin Tablets samples

［1］卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准——中药成方制剂［S］.第十二册.1997:26.

［2］李忠卓，张锦，赵晓玲，等.化痔灵片治疗痔疮365例［J］.辽宁中医杂志，2003，30(10):827.

［3］景志杰，牛拴成，张轩萍，等.化痔灵片对小鼠实验性疼痛的镇痛作用［J］.山西医科大学学报，2006，37(1):19-20.

［4］景志杰，牛拴成，张轩萍，等.化痔灵片对大鼠实验性炎症模型的抗炎作用［J］.山西医科大学学报，2006，37(3):264-265.