酶法制备1-磷酸葡萄糖合成条件的响应曲面法优化

王晓娟，靳利娥，畅芬芬，阎果兰

太原理工大学化学化工学院，山西 太原 030024

葡萄糖磷酸酯具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌和免疫调节剂等生物活性，人们已将其作为药物应用于临床[1-2]。目前合成葡萄糖磷酸酯方法有化学法[3-7]和生物酶法[8]。其中化学法存在选择性低、产物不单一等缺点，而酶的专一性使许多用化学法需多步合成的反应可一步完成。目前对葡萄糖磷酸酯合成大多以淀粉为原料酶催化合成。但由于淀粉在热的碱性环境中易分解，而使得磷酰化产物复杂、纯度不高，对合成条件仅进行单因素优化[9-10]。响应曲面法是以回归模型作为函数估算的工具，是一种优化反应条件的有效方法[11-13]。为了提高产物的纯度，使产物单一，本实验以葡萄糖为底物，具有选择性较强的三聚磷酸钠为磷酰化试剂，马铃薯磷酸化酶为催化剂，合成1-磷酸葡萄糖，以产物含量为标准响应曲面法优化合成条件，获得最优的合成工艺参数。寻找出了一条可信度高，试剂残留较少，纯度高的葡萄糖磷酸酯合成工艺路线。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

实验使用试剂均为分析纯；马铃薯 Solanum tuberosum购于农贸市场。Bruker Biospin GmbH核磁共振仪 (德国)，UV-9100紫外可见分光光度计(北京瑞利)。

1.2 方法

1.2.1 制备1-磷酸葡萄糖

磷酸化酶的提取：称150 g预冷24 h的马铃薯，粉碎，匀浆，按照文献[14]提取磷酸化酶。双缩脲法测定其蛋白含量为77.93 mg/mL。

1-磷酸葡萄糖制备过程：将三聚磷酸钠和葡萄糖及提取的磷酸化酶混合，调pH为8，30 ℃～40 ℃反应12～24 h煮沸，冷却，离心弃沉淀；上清液按照文献[14]进行粗制和精制得产物。

反应方程式如下：

1.2.2 1-磷酸葡萄糖磷含量的测定

按照文献[14]采用钼蓝标准曲线法，以标准磷含量 (μg)为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线，并测定1-磷酸葡萄糖的纯度。得到标准曲线方程为：Y=0.0486X−0.00043；R2=0.99968。磷含量P(%)和产物含量W(%)计算公式如下：

式中 m1：样品的磷含量 (μg)，m2：对照磷含量 (μg)，m：样品质量 (g)，n：稀释倍数，0.06607表示每毫升1-磷酸葡萄糖纯品磷含量。

1.2.3 响应曲面实验设计

实验考察单因素影响，选择了 pH，在此基础上根据响应面软件分析提供的模型，设温度、物料比 (葡萄糖/三聚磷酸钠)、时间三因素分别为自变量X1、X2、X3，产物含量为响应值，设计三因素三水平的实验，考察其交互影响，实验因素与水平的取值见表1。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels of the three-variable,three-level Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 响应曲面法优化制备工艺条件

利用Minitab14软件[15]设计实验并进行试验，测定的各因素条件下产物含量见表2。

对试验数据进行回归分析，得到产物含量在反应温度 (X1)、物料比 (X2)和反应时间 (X3)各因素条件下的二次多项回归模型为：

对该模型方程进行方差分析，F =33.62＞F0.05(9,2)=10.38，P=0.001＜0.01，R2=0.984，说明模型拟合程度良好，可用该模型预测制备1-磷酸葡萄糖的工艺条件。Box-Beknhen试验设计，得到各个因素对产物含量的交互影响的响应曲面图见图 1(A∶温度-时间，B∶时间-物料比，C∶温度-物料比)。

表2 Box-Beknhen试验设计及结果Table 2 Experimental conditions and results of Box-Behnken design

由图1A可看出，温度对产物含量的影响较强，温度过高和过低时产物含量均较低，当温度为35 ℃时产物含量最高，与温度对产物含量相比，时间的改变对产物含量的影响不明显。当物料比在1.35∶1 (mol/mol)，时间在19 h附近可获得较高的产物含量 (图 1B)。当温度为 35 ℃，物料比为 1.35∶1 (mol/mol)附近时可获得较高的产物含量 (图1C)。

利用Minitab14软件的Response Optimizer优化的工艺条件：温度 35 ℃、时间 19 h、物料比1.35∶1，在此条件下按照模拟方程计算出产物含量的预测值为69.62%。为验证所得结果的可靠性，按照上述优化条件重复试验3次，测得的平均产物含量为 68.06%，与预测值相比，其相对误差为2.29%。优化的1-磷酸葡萄糖合成工艺参数和文献[6]相比，具有使用的温度低、选择性强、产物较纯、低毒的特点。

2.2 核磁共振波谱

图2为以氘代水 (纯度99.9%)为溶剂，频率为600.13 MHz，Bruker Biospin GmbH共振仪测试产物1H NMR图。由图2可知，质子数比大约为5∶2∶1∶3，分别为产品糖环上的5个H，和3个羟基的3个H，C6上的2个H和羟基的1个H。结果与Spectral Database for Organic Compounds数据库一致，且符合反应后的糖环结构，环上仅有一个羟基被取代。表明产物单一，合成了1-磷酸葡萄糖。

图1 各因素对产物含量的交互影响响应曲面图Fig. 1 Response surface of the effect on product contents about interactive influence. (A)Temperature-Time. (B)Time-Molar ratio. (C)Temperature-Molar ratio.

3 结论

利用响应曲面法对马铃薯磷酸化酶催化合成1-磷酸葡萄糖酯的条件进行了优化。Minitab软件对合成过程的影响因素进行了分析。考察了温度、物料比、时间的交互影响，并对模型进行了验证。采用核磁共振仪对产物的结构进行了分析。确定了最佳合成条件是：温度35 ℃，葡萄糖与三聚磷酸钠物料比为1.35∶1 (mol/mol)，时间19 h。经验证，实验值与方程预测值较为接近，因此，响应曲面法优化1-磷酸葡萄糖的合成工艺参数准确可靠，纯度较高，可达68.06%。核磁谱图也反映了产物单一。

图2 1H NMR谱图Fig. 2 1H NMR spectra.

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