戊巴比妥钠处理后SD大鼠体内外精子运动功能分析

宋翼升，周国亮，由振强，辛艳飞，黄敏聪，宣尧仙

（浙江省医学科学院安全性评价研究中心，浙江 杭州 310013）

戊巴比妥钠属一种巴比妥类麻醉剂，为中枢神经系统抑制药物，随剂量由小到大，相继出现镇静、催眠、抗惊厥和麻醉作用。戊巴比妥钠为中等药效的催眠药，作用时间可维持3～6 h，具有显效较快、成本低廉和来源方便等特点，现主要用于动物实验，是较为常用的麻醉药物之一，对大鼠、小鼠和犬等都有很好的麻醉作用［1］。在以往的雄性生殖毒性试验中一般采用颈椎脱臼法处死大鼠后再进行精子等的功能分析，随着动物福利意识的加强，直接脱颈椎法已经不适应当前形势，现在常采用麻醉后再取样的方法。但是麻醉品对精子的活力是否有影响或者与药物是否产生协同作用，本文采用体内和体外两种给药方案，运用计算机辅助分析仪研究戊巴比妥钠对大鼠的精子运动功能的影响，为以后在生殖毒性雄性大鼠精子实验中麻醉药物的选择与使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

戊巴比妥钠，批号：WS20110112，购自上海西唐生物科技有限公司；无酚红 M199培养液，批号：1115727，购自美国Gibco公司；无支原体胎牛血清，批号：120104，购自浙江天航生物科技有限公司；0.9%氯化钠注射液，批号：2011060824，购自回音必集团（江西）东亚制药有限公司。戊巴比妥钠使用前用0.9%氯化钠注射液配制成1%（W／V）溶液。M199培养液在临用前中加入0.5%的无支原体胎牛血清，混匀，分装并保存在37℃培养箱中。在体外实验时，戊巴比妥钠由含0.5%无支原体胎牛血清的M199培养液配制而成。

1.2 动物

SD雄性大鼠，45只，SPF级，体质量300～350 g，大于90 d龄，购自上海西普尔－必凯实验动物有限公司，实验动物生产许可证：SCXK（沪）2008－0016，动物质量合格证编号：2008001619942。大鼠饲养于屏障环境动物实验室中，温度20～25℃，相对湿度40%～70%，中央空调集中通风10～20次／h，光照12 h暗／12 h明，适应性饲养1周后进行实验。

1.3 仪器

TOX－IVOS型计算机辅助精子分析仪，美国Hamilton公司产品，用于精子活力和浓度分析；2 X－CEL分析玻片的深度为80μm。PHG－9023 A型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司产品。

1.4 体外实验检测精子的活力

SD大鼠3只，颈椎脱臼法处死，按文献报道采用扩散法获取精子［1］。分离附睾尾并迅速转移到已预温37℃的M199培养液中，用眼科剪剔除附睾尾上附着的脂肪组织。静置1～2 min后将附睾尾转移至另一个3 ml 37℃的M199培养液的培养皿中，用眼科剪沿附睾尾纵向切3～5刀，再将此培养皿置于37℃培养箱中扩散5 min，移去剩余的附睾组织即得精子悬液。将精子悬液保存在37℃恒温培养箱中，吸取一定量的精子悬液与培养液按1∶9比例稀释后，用计算机辅助精子分析仪测得精子密度为（6.36～6.78）×105L－1，之后吸取等量的精子悬液分成6组，其中5组同时加入戊巴比妥钠，使戊巴比妥钠终浓度为1000，100，10，1和0.1μmol·L－1，正常对照组则加入等量的M199培养液，每组做3个重复样本。轻轻混匀后，放置于37℃恒温培养箱中孵育，分别给予戊巴比妥钠1和2 h后，用计算机辅助精子分析仪检测精子活力（motility，MOT）及运动功能参数。抑制率（%）＝（MOTt－MOT0）／MOT0×100%，MOT0为77%，MOTt为暴露t时间后的精子活力。精子运动参数变化（%）＝戊巴比妥钠组运动参数／对照组运动参数×100%。

1.5 体内实验检测精子的活力

SD大鼠42只按体质量随机分成4组，每组7只，其中戊巴比妥钠大鼠组经ip给予戊巴比妥钠0.04 g·kg－1溶液，正常对照组给予0.9%的氯化钠注射液，给药容量均为4 ml·kg－1。戊巴比妥钠组的大鼠分别在给药后15，60及120 min进行解剖，迅速取出单侧附睾尾称质量并制备精子悬液，37℃孵育5 min后，精子悬液稀释至精子密度为（4.95～7.46）×105L－1。正常对照组则用颈椎脱臼法处死后同法制备精子悬液。采用计算机辅助精子分析仪检测精子活力。

1.6 大鼠精子运动能力检测

预热精子分析仪，使载物台及分析玻片保持在37℃左右，吸取上述体外或体内实验精子悬液10μl置于分析玻片上，在4倍镜下，蓝光，记录精子运动的图像，用计算机辅助精子分析仪分析精子运动轨迹，每个样品至少观察5个视野，使所观察的精子总数大于200个。精子分析仪通过对影像的分析得出精子运动的相关参数，包括精子运动参数包括曲线运动速度（curvilinear velocity，VCL），平均路径速度（average pat h vel ocity，VAP），直线运动速度（straight line velocity，VSL），鞭打频率（beat cross frequency，BCF），精子头侧摆幅度（amplit ude of lateral head movement，AL H），直线性（linearity，LIN），前向性（straight ness，STR）等。整个实验操作过程室温不可低于27℃。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 戊巴比妥钠对体外大鼠精子运动功能的影响

如图1所示，与正常对照组相比，戊巴比妥钠0.1，1，10，100和1000μmol·L－1对体外精子活力抑制率无明显影响。与正常对照组比较，大鼠附睾精子体外给予戊巴比妥钠0.1，1，10，100和1000μmol·L－11和2 h后，其附睾尾精子运动功能参数MOT，VCL，VAP，VSL，BCF，AL H，LIN和STR等均无显著性差异（表1）；戊巴比妥钠0.1，1，10，100 和 1000 μmol·L－1组 在 给 药 后1和2 h后精子运动参数变化率与正常对照组没有明显差别，戊巴比妥钠1000μmol·L－1组1和2 h后精子运动功能参数区间范围分别为94%～107%和92%～108%（图2）。戊巴比妥钠1000μmol·L－1组的单个精子运动精力充沛，运动轨迹呈直线前进性（图3B），与正常对照组相似（图3 A）。

Fig.1 Effect of pentobar bital sodium （PS）on the motion of Sprague Dawley rat sper m in vitro for 1 and 2 h.The sper m suspensions were divided into 6 groups，cult ured wit h pentobar bital sodiu m 0（control），0.1，1，10，100，1000μmol·L－1 at 37℃f or 1 and 2 h.Inhibtory rate（%）＝（MOTt－MOT 0）／MOT 0×100%，MOT 0 means t he initial motility t hat is equal to 77%；MOTt means motilityafter PS treat ment f or t ti me.±s，n＝3.There was no significant difference compared with nor mal control group.

Tab.1 Effect of PS on motility parameters of epididy mal sper m of rats in vitro

Fig.2 Effect of PS on relative change rate of motility parameters computer－assisted sper m analysis for 1 h and 2 h in vitro.See Fig.1 f or treat ment.The relative change rate of motility parameters（%）＝val ue of motility parameter in pentobarbital sodiu m group／val ue of motility parameter in control group×100%.The abbrevation see Tab.1.STR（%）＝VSL／VAP×100%.LIN（%）＝VSL／VCL×100%.

2.2 戊巴比妥钠对大鼠体内精子运动功能的影响

Fig.3 Effect of PS f or 2 h on representative sper m tracks and individual computer－assisted analysis of rat sper m in vitro.See Fig.1 f or treat ment.Individual sper m tracks were reconstr ucted fro m t he X，Y coor dinates saved into t he ASCⅡfiles.A：nor mal control group.B：PS 1000μmol·L－1 group.

如表2所示，SD大鼠ip注射戊巴比妥钠15，60和120 min后，其附睾尾精子运动功能参数MOT，VCL，VAP，VSL，BCF，AL H，LIN，STR等与同时间正常对照组比较均无显著性差异。戊巴比妥钠组的单个精子运动精力充沛，精子运动轨迹呈直线前进性，与正常对照组相似。

Tab.2 Effect of PS on motility parameters of Cauda epididymal sper m in vivo

3 讨论

近年来，随着雄性生殖毒理研究的深入，提出了以精子形态结构和精子运动能力等作为雄性生殖功能影响重要观察点［2］。一般认为，精子的运动包括两方面，即运动速度和运动方式［3］。在研究技术上，传统的精子活力测定方法是利用显微镜进行人工判断，分析结果受到检测者个人主观因素的影响，实验室中不同检测者间以及不同实验室间可比性较差。目前一般采用计算机辅助精子分析仪检测精子运动能力，它是建立在显微摄像基础上的计算机精子运动图像处理自动分析系统，重复性和一致性均优于人工检测，并且能快速准确地测定精子的密度、活率、活力等参数，重复性好，可比性强，敏感性高，还可以提供描述精子实时运动状态的多种参数［4］。

精子的运动能力是精子结构变化和功能状况的综合体现，是完成受精过程的基础，在雄性生殖毒理学研究中都把其作为衡量精液质量的主要指标之一。精子运动功能参数中，精子活力下降会导致生育率下降［5－6］，VCL，VSL和 AL H 等运动参数与受精率呈明显相关关系［4－5］，因此，精子的运动能力可作为男（雄）性生殖毒性评价的早期敏感指标。通过体外给药实验可以直观、简便地观察到药物对精子的活力是否存在直接影响，对雄性生殖毒理学研究有十分重要的意义。

动物实验中常规使用的麻醉药物主要有戊巴比妥钠、盐酸氯胺酮、乌拉坦、乙醚、三氟溴氯乙烷、氟烷、二氧化碳等。与其他麻醉药相比，戊巴比妥钠麻醉操作简便，实验过程无需专人管理麻醉，麻醉过程较平稳、安全，易保存，在动物实验中广受科研工作者的青睐。然而国内学者在戊巴比妥钠对精子运动功能的影响方面研究甚少。本研究结果显示，在戊巴比妥钠体外浓度高达1000μmol·L－1时，作用120 min对精子的各运动功能参数均无明显影响，精子的运动方式也并未改变，与正常对照组基本相似。体内实验也发现戊巴比妥钠对精子的运动速度参数VCL，VAP，VSL和BCF以及运动方式参数AL H，LIN和STR均无明显影响，这与Sl ott等［7］报道的结果基本一致。

总之，戊巴比妥钠给药后，并不影响大鼠精子运动速度和运动方式，可以作为生殖毒性实验的麻醉用药，为将来雄性动物生殖毒性的研究工作提供了一定理论基础。

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［4］Moore HD，Akhondi MA.Fertilizing capacity of rat sper mat ozoa is correlated wit h decline in straight－line velocity measured by continuous co mputer－aided sper m analysis：epididymal rat sper matozoa from the proxi mal cauda have a greater fertilizing capacity in vitro than those from the distal cauda or vas deferens［J］.J Andr ol，1996，17（1）：50－60.

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