邻近拔牙创植入正畸微种植体骨界面愈合的组织学研究

周阳明等

[摘要] 目的 通过组织形态学观察和定量测定，比较拔牙创对种植体—骨界面愈合进程的影响，并对正畸微种植体骨整合的安全范围进行探讨。方法 12只雄性Beagle犬，按不同愈合时间段（1、3、8、12周）随机分成4组，建立邻近拔牙创植入正畸微种植体实验动物模型。在植入微种植体后愈合的第1、3、8、12周处死各组动物，制备含种植钉的硬组织切片，观察组织学形态，并测定微种植体—骨界面骨接触率（BIC）。结果 实验组和对照组在植入后第3周开始出现组织学变化的明显差异：实验组骨界面骨吸收活跃；对照组骨界面出现新生骨层，周边存在活跃成骨细胞。对照组在植入后前8周，BIC值随着时间的增加而增加。实验组BIC值在植入3周后有所下降，到第8周达到峰值（80.08%），随后进入平台期。两组BIC的差异表现在植入后第3周：实验组BIC（44.35%）小于对照组（55.46%），二者差异有统计学意义（P<0.01）。结论 拔牙创对微种植体周围骨重建进程会产生影响，早期表现为加重骨吸收，但在随后的时间里骨形成效应会迅速加强。

[关键词] 拔牙创； 骨整合； 骨接触率； 骨重建

[中图分类号] R 783.5 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.05.016

骨整合（osseointegration）的定义为：在光学显微镜下，高分子、有生命的骨组织直接与种植体表面接触[1]。种植体—骨界面的骨整合率越高，种植体的稳定性就越高[2]。目前在正畸临床中利用微种植体提供最大支抗已逐渐普及。随着正畸成年患者的日益增加，龋坏牙齿局限了正畸医师拔牙位置的选择，很多情况下，正畸医师不得不在拔牙远中骨质区域植入微种植体以整体内收前牙。微种植体行使功能时涉及的力学单位包括：移动牙、拔牙创和微种植体。拔牙创骨质结构改建是否会影响牙齿的移动及牙体、牙周健康，是否会影响微种植体作为正畸支抗的稳定性是值得探讨的问题。研究[3-4]证实，拔牙创和微种植体—骨界面的愈合进程存在相关性，并且受愈合时间的影响[4]。本实验通过制作带种植钉的超硬组织切片[5]，观察拔牙创对种植体—骨界面愈合进程的影响；同时采用微种植体—骨界面的骨接触率（bone implant contact ratio，BIC）来反映骨整合率，定量分析邻近和不邻近拔牙创两种情况下微种植体—骨界面结合的异同。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选用健康雄性Beagle纯种犬12只（重庆医科大学实验动物中心提供），体重13～14 kg，年龄18个月，要求第四前磨牙已萌出，牙体、牙列完整，无龋坏及牙周病，咬合关系正常。所有Beagle犬均采用笼中特殊饲养的方法，定时、定量摄食，自由饮水，适应性饲养1周后进行实验。

1.2 实验材料和设备

Aarhus microscrew自攻型纯钛微种植钉（Medi-con公司，德国）；氯氨酮、注射用青霉素钠（河北省石家庄市华北制药集团有限责任公司）；过氧化苯甲酰、邻苯二甲酸二丁酯、二甲苯、甲基丙烯酸甲酯（上海昊化化工有限公司），脱钙液（体积分数10%的甲醛溶液92 mL+浓硫酸8 mL）；高速涡轮机（CS181型，上海医疗器械有限公司），Leica 1600型硬组织切片机、常规轮转石蜡切片机（Leica公司，德国），光学显微镜（Nikon公司，日本）。

1.3 建立邻近拔牙创植入微种植体实验动物模型

1.3.1 实验分组 12只Beagle犬随机分为4组，按植入后第1、3、8、12周编号，每组3只动物。实验组微种植体在每只Beagle犬拔除上下颌第三、四前磨牙后的拔牙区域（图1）植入，共96枚，对照组微种植体在每只Beagle犬上下颌第二前磨牙、第一磨牙的非拔牙区域植入，共96枚。

箭头所指为实验组，其余为对照组。

图 1 拔牙后植入微种植体

Fig 1 Microscrew implantation after extraction

1.3.2 手术过程 Beagle犬手术前30 min肌注阿托品0.1 mg，以氯胺酮（1 mL·kg-1）静脉注射行全身麻醉后，四肢固定于犬固定床上，绷带张口固定，消毒铺巾。含肾上腺素2%利多卡因局部浸润注射于术区口腔前庭沟底，以减少术区出血和保证麻醉深度。高速涡轮机离断第三、四前磨牙近远中向牙根，用拔牙钳拔除近远中向牙根后，牙槽复位。在Beagle犬口腔植入位置切开黏骨膜，充分暴露颊侧骨质，低速引导钻钻开皮质骨，使用就位器将微种植体植入到位。微种植体全部植入后拍摄颌骨X线片。术后1～5 d肌肉注射青霉素以预防感染。

1.4 制备含种植钉的硬组织切片

处死动物后取下带种植体的下颌骨，修整标本，要求每个组织块均包含1枚种植钉和其周围至少4 mm的骨质，无软组织。将标本置于多聚甲醛液中固定1周后，按照常规程序进行梯度脱水和组织块包埋。在硬组织切片机上将组织块固定，在流水冷却下对组织块进行慢速切割，切片方向平行于种植体长轴，切片厚度约50 μm，含种植体的硬组织切片采用甲苯胺蓝（toluidine blue，TB）染色。

1.5 组织形态学观察

采用计算机图像分析系统在显微镜下观察界面骨重建过程以及相关细胞的形态，同样利用计算机图像分析系统采集硬组织切片图像。

1.6 测定微种植体—骨界面BIC

在低倍（放大40倍）镜下，对硬组织标本的界面骨组织摄像，利用Image Pro-Plus软件分别对每个图像的种植体—骨结合界面进行静态骨组织形态测量，根据下列公式计算BIC[5]：BIC=种植体螺纹与骨接触部分的长度/种植体螺纹界面的长度×100%。每个硬组织标本取2张切片求其平均值。

1.7 统计学处理

BIC结果输入SPSS 10.0软件包进行统计学处理，检验水准为双侧α=0.05。

2 结果

实验组和对照组植入的微种植体均没有松动。2组拔牙创的组织学形态见图2，微种植体—骨界面骨整合状态见图3。

2.1 组织学观察

第3周时，拔牙创可观察到有大量胶原纤维排列成网状，里面有许多血管样空洞（图2左），有网状骨形成，尚未见骨小梁；第8周时已经出现成熟的骨小梁结构，网状骨逐渐向板状骨过渡（图2中）；第12周时，拔牙创内骨密度已经明显增加，存在粗大骨小梁，形态接近正常牙槽骨（图2右）。

微种植体—骨界面比较：植入后第1周，实验组和对照组微种植体—骨界面均以大量排列紊乱的肉芽机化组织居多（图3A、F）；植入后第3周，实验组和对照组微种植体—骨界面炎症反应均有所减轻，实验组以大量结缔组织取代肉芽组织，但尚未见新骨形成，血管化现象不明显，对照组结缔组织较实验组范围小，有较明显的血管化现象（图3B、G、H）；植入后第8周，实验组和对照组的微种植体—骨界面均可见与种植体直接接触的网状骨及少量的成骨细胞（图3C、I）；植入后第12周，实验组和对照组微种植体—骨界面出现钙化的层状骨，与旧骨密度相近呈束状排列，致密且规则，哈弗系统清晰可辨，骨内膜处骨结构成熟，高度钙化（图3D、E、J）。

2.2 BIC测定结果

实验组和对照组BIC的测定结果见表1。在各个愈合时期，BIC测量值均大于40%；仅在植入第3周，两组BIC的差异有统计学意义，对照组高于实验组（P<0.01）。对照组在植入后前8周的BIC值随着时间的增加而增加，8周后BIC值没有变化；实验组在植入后3周较植入后1周BIC值有所下降，但3周以后迅速升高，到第8周达到峰值（80.08%），随后进入平台期至12周。

3 讨论

3.1 含种植体的硬组织切片的优势

口腔颌面部组织结构复杂，种植体直接植入骨和软组织内[6]。在对微种植体—骨界面进行研究的过程中，选择优化的切片技术，使之能同时保持各种硬组织原有的结构形态是非常有用和必须的[7]。含种植钉硬组织切片是一项重要的检测技术[8]：组织块经包埋后，首先由硬组织切片机切成110～120 μm的切片，然后经自动磨片系统打磨成60～100 μm的磨片。与传统的硬组织切片技术相比，含种植钉的硬组织切片有其难点。金属种植钉的硬度高于骨组织，不但易损伤钨钢刀片，而且不易获得所需厚度。本研究为了解决这些问题，采用纯钛种植钉。纯钛在金属中硬度相对较低，而且正畸微种植钉体积较小，直径多为1.2～2.7 mm，长度多为5～12 mm，这为获得含种植钉的超硬组织切片提供了可能。采用专用硬组织切片机，可使同一标本获得数张磨片，有利于观察和统计；对切片速度和厚度进行适当的控制，对微种植体和骨组织进行整体切片，可以直接得到60～80 μm的超硬组织切片。

3.2 微种植体稳定性骨组织形态学定量测定的研究

骨组织形态学定量测定是一种用定量方法测量分析骨组织形态动态变化的技术。植入区种植体—骨界面的良好结合，不仅能提供抗位移的良好机械强度，还能分散种植体—骨界面的应力。组织定量分析方法较多，标准也不统一，常用的分析方法包括骨形成率和骨接触率，此外还包括骨体积比（参考面内的骨体积）、编织骨百分比（指定区域内的编织骨比例）、骨厚度（螺纹顶、底的厚度差）以及矿物沉积率（单位时间内的矿物沉积厚度）等[9]。骨形成率通过测定骨捕获腔（bone harvest chambers）或螺纹平面上单位时间内的骨生成量来确定[10]。从取自患者身上能稳定行使功能的种植体来看，人骨沉积率为60%～85%，也有人认为骨结合即相当于60%以上的骨接触率以及皮质骨内螺纹70%以上的骨充填率[11]。计算骨接触率有3种方式：1）总骨—金属接触面积/总长度，2）皮质骨内3个完整连续螺纹内的骨接触面积/总长度，3）螺纹内总骨面积/总长度或螺纹内外骨面积/总长度的比值[5]。在本实验中，通过图像处理还原低倍镜下整个种植钉与周围骨组织接触的直观图像，测量骨与种植体直接接触的面积占螺纹总长度的比例来计算骨结合率，结果显示，这种计算方法能够有效地反映骨界面骨整合情况，组织学表现能够解释统计结果，即量化指标和实际观测是一致的。

种植体—骨界面的骨整合情况受界面骨的钙化成熟度和结合率影响[11]，它决定着界面的结合强度与种植体的稳定性。研究[12]表明，修复用大种植体要求种植体与骨界面间骨整合率达到80%才能稳定。由于修复用大种植体所承受的是咬合力，力系复杂，而正畸用微种植体所承受的力为正畸力，力系较单一[7]，并且正畸微种植钉支抗的尺寸也比传统牙科种植体缩小了近50%，所以正畸用微型种植体对界面骨整合的要求并不像修复大种植体那么严格[9，11]。Roberts等[7]认为，种植体完全被新骨包绕并不是推断种植体支抗临床成功的组织学标准，10%的骨整合面积已经可以达到正畸力负载的要求。在本实验中，即使在尚处于炎症反应的第1周植入微种植体，各组的BIC值也均大于40%，远远高于Robert所认为的有效标准10%。由于种植体优良的初期稳定性取决于皮质骨的厚度，Beagle犬的下颌骨皮质骨非常肥厚，而人的颌骨尤其是上颌骨皮质骨比较薄[4]，因此本动物实验的结论直接转移至临床时需要多方权衡，还需进行更深层次的研究探索。

3.3 拔牙创愈合影响界面愈合情况

Beagle犬下颌骨皮质骨肥厚，在显微镜下观察种植钉植入后在皮质骨和松质骨之间的长度比例大概是1∶1[13]。植入后1周，镜下观察实验组和对照组没有明显差异，在松质骨界面表现为明显的炎症反应，有微小血肿形成。虽然界面的反应以炎症反应为主，此时的BIC值两组却都大于40%，没有表现出统计学差异。出现这种现象的原因，可能是因为本研究选择BIC作为衡量界面骨整合的指标，但BIC反映的是骨与种植钉直接接触的部分，这种接触并不代表界面有新骨形成。刚刚植入的微种植体，在最初的1周也许并没有表现出局部骨形成，但即使界面主要以机械嵌合形式存在，这种嵌合在显微镜下观察也是骨与种植钉直接接触，同时由于Beagle犬下颌皮质骨肥厚，而皮质骨表现嵌合的能力强于松质骨，因此第1周两组BIC均较高。

植入后第3周，本实验观察到对照组新骨形成的速度和范围都明显大于实验组，并且BIC值显著大于实验组。这个时期是拔牙创愈合后一个明显的骨萎缩阶段，说明拔牙创愈合过程中造成的局部骨密度下降在第3周左右可以明显影响微种植体植入后的界面骨重建，这与文献中报道局部骨密度的下降可以减慢界面骨形成的速度吻合。因为人的颌骨，尤其是上颌骨皮质骨厚度不像Beagle犬下颌那么肥厚，所以这种反应更加明显，这提示在临床上对拔牙创附近植入的种植钉在3周内应给予高度关注。在随后的时间里，界面骨重建随着时间的延长而日臻完善，两组BIC值没有表现出统计学差异。本实验设计为无载荷愈合，后续研究应进一步探索正畸力学加载对拔牙创邻近微种植体稳定性的影响，以更加明确地指导临床实践。

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（本文编辑 吴爱华）