环氧化酶-2 和β-连环蛋白及Survivin 在舌癌中的表达及相关性研究

王鹏 王敬 李乐 霍峰 王笑茹 李春辉

近年来，舌癌的基础和临床研究均取得了很大发展，深入研究其发生、发展机制，全面揭示其生物学特性，对判断其恶性程度，指导临床治疗和评估预后具有重要意义。目前有关环氧化酶-2(Cyclooxygenase-2，Cox-2)、β 连环蛋白(β-catenin)和凋亡抑制基因Survivin 蛋白与肿瘤的增殖、抗凋亡等关系的研究日益受到人们关注［1－3］。本研究采用RT-PCR 方法检测舌癌组织及正常口腔黏膜中Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 及Survivin mRNA 的表达情况，旨在探讨其在舌癌发生、发展过程中的作用及相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集我院口腔科2006 至2011 年手术切除及活检后经病理诊断明确的存档舌癌标本60 例，其中男37 例，女23 例;年龄40 ～75 岁;所有患者手术前均未经放疗、化疗或免疫治疗;所有舌癌病例均经承德医学院附属医院病理科资深医师组织病理学证实，病理诊断标准参照WHO 2002 年《头颈部肿瘤病理学与遗传学》，其中高分化19 例(高分化组)，中分化26 例(中分化组)，低分化15 例(低分化组)。收集舌外伤、舌修整正常舌黏膜组织30 例为正常对照。

1.2 标本处理检测标本置－70℃液氮中保存。

1.3 主要试剂(1)总RNA 提取试剂异硫氰酸胍(Trizol Reagent):美国Invitrogen Life technologies 公司;(2)反转录酶(AMV);(3)RNA 酶抑制剂;(4)dNTP 混合液;(5)Oligo(dT)15;(6)γ-Taq DNA 聚合酶;(7)目的基因引物:2 ～7 均购自日本TaKaRa 公司;(8)琼脂糖:购自美国Promaga 公司。

1.4 主要设备小型台式离心机(SIGMA，1-13)，PCR 扩增仪(德国Biometra)，紫外分光光度计(UV-visible Spectrometer，UV300)，电泳仪(BIO-RAD，PowerPac200)，Chemi Imager 5500凝胶电泳成像分析系统(Alphain-notech chemi Imager)。

1.5 方法

1.5.1 总RNA 的提取:TRIZOL 法提取组织总RNA，将－70℃冻存的组织取出，称取100 mg，在EP 管中剪碎，加入TRIZOL试剂1 ml，匀浆后移入EP 管，室温5 min 后加入0.2 ml 氯仿，振动15 s，室温2 ～3 min。12 000 r/min 离心15 min 后将上清移入新管。每管加0.5 ml 异丙醇，室温10 min，沉淀RNA，12 000 r/min离心10 min 后，去除上清，加1 ml 75%乙醇。漩涡振荡后7 500 r/min 离心5 min。干燥RNA，加入DEPC 处理水20 μl。紫外分光光度计测OD260 与OD280，二者比值应1.8～2.0，提示样本中无蛋白剩余。RNA(μg/μl)浓度=OD260×40×稀释倍数/1 000。

1.5.2 引物合成:根据文献及GenBank 提供RNA 序列确定引物，Cox-2 正向引物5’-TTCAAATGAGATTGTGGGAAAATTGCT-3’，反向引物5’-AGATCATCTCTGCCTGAGTATCTTT-3’，扩增片段长度305 bp。β-catenin 正向引物5’-TGGCCTGGTTTGATACTGACCT-3’，反 向 引 物5’-CTCTACAGGCCAATCACAATGC-3’，扩增片段长度383 bp。Survivin 正向引物5’-GATGGGTGCCCCGACGTTG-3’，反向引物5’-TCAATCCATGGCAGCCAGCT-3’，扩增片段长度430 bp。β-actin 正向引物5’-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3’，反向引物5’CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3’，扩增片段长度318 bp。

1.5.3 RT-PCR 反应:逆转录反应采用20 μl 体系。Oligo dT 1 μl，细胞总RNA 0.5 μg，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，DEPC 处理DDW 至13 μl，混合后加热至75℃，5 min 后移至冰上使其迅速冷却。快速离心后加入5×buffer 4 pl，加热至42℃，2 min 后加入逆转录酶1 μl，42℃保温50 min 后，70℃、15 min 灭活逆转录酶。PCR 反应体系为25 μl(10×buffer 2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP 2 μl，目的序列上下游引物各1 μl，cDNA2 μl，Taq 酶0.5 μl)。反应条件为95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，共30 个循环;72℃延伸10 min。

1.5.4 PCR 产物的检测和分析:取5 μl PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳30 ～50 min，紫外灯下照相，用凝胶成像处理系统对每一样品PCR 产物扩增的特异性片段进行扫描，以β-actin 密度作为参考定量标准，目的基因Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 和Survivin mRNA 的表达量分别以Cox-2、β-catenin 和Survivin 与β-actin 密度之比表示。

1.6 统计学分析应用SPSS 13.0 统计软件，采用单因素方差分析，相关性用Pearson 相关分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 和Survivin mRNA 的表达情况在305 bp 处可见有Cox-2 条带，382 bp 处可见β-catenin 条带，430 bp 处可见Survivin 条带。60 例舌癌中Cox-2、Survivin的表达明显增高，而在30 例正常黏膜中未见表达;β-catenin 在正常黏膜和舌癌中均见表达，但表达强度显著不同。见图1 ～3。

图1 Cox-2 mRNA 在各组中的表达

图2 β-catenin mRNA 在各组中的表达

图3 Survivin mRNA 在各组中的表达

2.2 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表达Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA、Survivin mRNA 表达随分化程度的降低而升高，低分化组Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA、Survivin mRNA 表达显著高于高、中分化组(P ＜0.05)。见表1。

表1 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表达±s

表1 不同分化程度舌癌中Cox-2、β-catenin、Survivin mRNA 的表达±s

注:与低分化组比较，*P ＜0.05

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2.3 Cox-2 mRNA、β-catenin mRNA 与Survivin mRNA 的表达的相关分析Cox-2 mRNA 与β-catenin mRNA 的表达呈正相关(r=0.856，P ＜0.01);Cox-2 mRNA 与survivin mRNA 的表达呈正相关(r=0.985，P ＜0.01);β-catenin mRNA 与Survivin mRNA 的表达呈正相关(r=0.857，P ＜0.01)。

3 讨论

Cox-2 是一种催化致炎性物质地诺前列酮合成的重要限速酶，在体内呈诱导性表达，在生理状态下多数组织不表达Cox-2。当受到炎性细胞因子、生长因子和内毒素以及某些有丝分裂原的刺激时，Cox-2 的表达水平增强。Cox-2 过度表达可导致地诺前列酮的合成增加，进而促进许多肿瘤的形成。Iniesta等［4］提出通过检测患者血清中Cox-2 的表达对非小细胞癌进行诊断、分期及对预后的评估，既有效又简便。在本实验中，经过对舌癌组织及正常黏膜组织中Cox-2 的表达水平进行测定发现:在正常组织中未见表达，Cox-2 在舌癌中的表达明显增强。实验结果显示，Cox-2 阳性表达与舌癌组织的分化程度呈负相关，低分化舌癌与高中分化舌癌差异有统计学意义(P ＜0.05)。舌癌组织中Cox-2 高表达，可能与其诱导细胞增殖、抑制凋亡、增强肿瘤的侵袭性及转移活性，促进VEGF 生成从而促进肿瘤血管的形成有关［5，6］。这提示Cox-2 可能会是一个有价值的指标用以判断舌癌进展的恶性程度。

β-catenin 是一种由连环蛋白基因(CTNNB1)编码的多功能蛋白质。β-catenin 的表达变异会关系到肿瘤中骨架蛋白及调控作用的改变，从而加速肿瘤的恶性转变［7］。Fuchs 等［8］的实验研究中显示β-catenin 可通过形成特定复合物，参与口腔鳞状细胞癌的生物学行为过程。Yasusei 等［9］对一个口腔鳞状细胞癌细胞系的淋巴结转移灶进行了分析研究，结果表明，母细胞的侵袭能力显著低于无性繁殖系。本实验通过应用RT-PCR技术，检测了β-catenin 在舌癌组织及正常黏膜组织中的表达，结果表明，在正常组织及舌癌组织中β-catenin 均有表达，但表达强度有明显差异;比较分析高中分化舌癌与低分化舌癌间的关系，发现差异有统计学意义(P ＜0.05)。这表明，β-catenin可能作为舌癌的一个重要预后因子用于舌癌的恶性程度的判断及指导临床治疗工作;β-catenin 还可能是舌癌进展的重要调控因子，其机制可能与肿瘤细胞中的Wnt 信号通路异常和细胞失去黏附功能导致细胞分散，癌细胞表型改变获得高侵袭性有关［10］。

Survivin 是IAP(凋亡抑制蛋白)家族的最新成员，位于染色体17q25，全长15kb。Marusawa 等［11］认为Survivin 通过抑制Caspases-9 的活性来诱导细胞凋亡，而不是Caspases-3 和Caspases-7。Lo Muzio 等［12］的实验研究表明Survivin 在口腔癌病变向侵袭性癌的转变过程中，具有重要评估意义。本实验通过RT-PCR 技术检测Survivin 在舌癌及正常黏膜中的表达，结果发现:Survivin 在正常黏膜中未见表达，而在舌癌中高表达，且与组织分化程度有一定关系，统计分析发现呈负相关;这提示Survivin 可能是舌癌的一个重要调控指标。Survivin 与其他肿瘤指标之间是如何相互作用和联系的，我们仍需要进一步研究。

舌癌的发生发展是由多个基因参与、多种因素共同作用的结果。进展过程中Cox-2、β-catenin 和Survivin 基因之间存在密切关系，它们在肿瘤的发生发展中可能相互影响。Cox-2 与βcatenin 的表达相互促进，Cox-2/β-catenin 通路上调Survivin 的表达，Survivin 又促进癌细胞的增殖。它们之间可能存在特殊的调控关系，其具体作用机制有待于我们进一步探讨。

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2 Lim K，Han C，Dai Y，et al.Omega-3 polyunsaturated fatty acids inhibit hepatocellular carcinoma cell growth through blocking β-catenin and cyclooxygenase-2.Mol Cancer Ther，2009，8:3046-3055.

3 Stenner M，Demgensky A，Molls C，et al.Prognostic value of survivin expression in parotid gland cancer in consideration of different histological subtypes.European Journal of Cancer，2011，47:1013-1020.

4 Iniesta P，Moran A，De Juan C，et al.Biological and clinical siguificance of MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TIMP-2 in non-small cell lung cancer.Oncol Rep，2007，17:217-223.

5 Queiroga FL，Pires I，Parente M，et al.COX-2 over-expression correlates with VEGF and tumour angiogenesis in canine mammary cancer.The Veterinary Journal，2011，189:77-82.

6 王维丽，张英怀，张杰英，等.口腔鳞状细胞癌中COX-2、VEGF 和EGFR 的表达及意义.现代口腔医学，2006，20:277-280.

7 Brabletz T，Hlubek F，Spaderna S，et al.Invasion and metastasis in colorectal cancer:epithelial-mesenchymal transition，mesenchymal-epithelial transition，stem cells and beta-catenin.Cells Tissues Organs，2005，179:56.

8 Fuchs SY，Ougolkov AV，Spiegelman VS，et al.Oncogenic beta-Catenin Signaling Networks in Colorectal Cancer.Cell Cycle，2005，4:1522-1539.

9 Yasusei K，Shojiro K，Ikuko O，et al.Invasion and metastasis of oral cancer cells require methylation of E-cadherin and/or degradation of membranous β-catenin.Clin.Cancer Res，2004，6:5455.

10 张卫民，高岩.Wnt 信号传导通路组成蛋白与口腔鳞状细胞癌的分化和增殖.中华口腔医学杂志，2005，40:491.

11 Marusawa H，Matsuzawa S，Welsh K，et al.HBXIP functions as a co-factor of survivin in apoptosis supperssion.EMBO，2003，22:2729-3740.

12 Lo Muzio L，Pannone G，Leonardi R，et al.Survivin，a potential early predictor of tumor progression in the oral mucosa.J Dent Res，2006，82:923-928.