旋毛虫感染对过敏性哮喘小鼠血清总IgE、IL-4、IL-5 的影响

马 萍，闫玉文，包春雨

随着过敏性疾病的日趋增多，其发生与环境的关系日益受到重视［1］。虽然哮喘发病率增高的原因较为复杂，但相关统计数据显示，环境与个人卫生水平与过敏性疾病的发生呈负相关［2］，与寄生虫、细菌或病毒的感染率降低有关，现代都市化生活降低了感染寄生虫和微生物的机会，导致免疫系统受病原体刺激减少，可能会引起免疫系统发育的改变及炎性因子失控表达［3］。过敏性哮喘的发病是否与蠕虫感染有关，多位研究者的结果并不尽相同。Flohr 等［4］发现钩虫感染可降低哮喘的发生，Smits等［5］研究提示曼氏血吸虫感染对气道炎性反应具有保护作用，而Pinelli 等［6］认为，犬弓蛔虫感染加重过敏性气道炎性反应。研究结果的迥异，提示可能不同的蠕虫感染对变态反应呈现不同的作用，同时也可能有多种因素会影响两者间的关系［7］。

旋毛虫感染对过敏性哮喘的作用机制目前尚不清楚。为此，本实验以BALB/c 小鼠为实验研究对象，首先建立旋毛虫感染小鼠模型，在此基础上以OVA 诱发小鼠过敏性哮喘，通过测定单纯过敏性哮喘鼠和旋毛虫感染后哮喘鼠血清中总IgE、IL-4 及IL-5 水平变化，观察旋毛虫感染对过敏性哮喘的影响，并初步探讨其可能的免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 雌性BALB/c 小鼠20只，8周龄，购自北京军事医学科学院。随机分为4组，每组5 只，Ⅰ组为空白对照组，Ⅱ组为单纯过敏性哮喘组，Ⅲ组为感染旋毛虫并发哮喘组。Ⅳ组为单纯感染旋毛虫组。

1.1.2 主要试剂 卵清白蛋白(Ovalbumin，OVA)(美国Sigma 公司生产，Ⅱ级);TIgE、IL-4、IL-5 ELISA 检测试剂盒(美国R＆D Systems 公司生产);胃蛋白酶(Pepsin，北京奥博星生物技术有限公司)。

1.1.3 主要仪器 电子天平(AG204 DeltaRange，瑞士Mettler Toledo)，生物显微镜(Olympus，日本)，超低温冰箱(Sanyo，日本)，酶联免疫检测仪(DG3022A，南京华东实验仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 建立小鼠模型 Ⅰ组小鼠不做任何处理，与其他组小鼠同条件饲养，自由饮水，颗粒饲料喂养，室温20～26℃。

1.2.1.1 建立旋毛虫感染模型 Ⅲ、Ⅳ组小鼠建立旋毛虫感染模型，方法如下:(1)绞碎含有旋毛虫囊包幼虫的小鼠肌肉，放置于含有人工消化液(100 ml 蒸馏水+1 g 胃蛋白酶+0.8 ml 盐酸)的烧杯中，肉样与消化液的比例为1∶30(W/V)，充分搅拌均匀;(2)放37℃温箱中，经10～18 h 充分消化后(期间经常搅拌)，将上层液及漂浮物小心倒掉，加生理盐水洗涤3次，过滤;(3)幼虫沉淀物加3%明胶生理盐水调匀，每只小鼠经灌胃法感染200～300 条。实验结束时，Ⅲ、Ⅳ组小鼠均取取腓肠肌压片镜检，低倍镜下可见肌纤维内卷曲的旋毛虫囊包幼虫，即为旋毛虫感染模型成功。

1.2.1.2 建立过敏性哮喘模型 Ⅲ组感染旋毛虫28 d 后和未作任何处理的Ⅱ组小鼠，建立哮喘动物模型。(1)1 mg OVA 溶于2 ml PBS 中，吹打混匀;(2)加2 ml 10% KAL(SO4)2，充分混匀;(3)逐滴将10 mol/L NaOH 加入到上述混合液中，调整pH值为6.5;(4)室温孵育60 min 后，2500 r/min，离心5 min，弃上清，加PBS 使其终体积为2 ml，轻轻吹打混匀;(5)每只小鼠腹腔注射200 μl OVA 混悬液，其中含有OVA 100 μg，KAL(SO4)22 mg;(6)第14天重复上述操作;(7)第21～27 天，连续7 d，用乙醚麻醉小鼠后，鼻内滴入50 μl 含50 μg OVA 的PBS 混悬液进行致敏激发。激发后Ⅱ组小鼠出现呼吸急促、节律不整，点头呼吸，烦躁不安，二便失禁、发绀等现象，Ⅲ组小鼠略有呼吸急促、节律不整现象，无明显烦躁、发绀现象。

1.2.2 血清的收集处理 56 d 后，摘取小鼠眼球取血，4℃冰箱静置过夜，3 000 r/min，离心10 min，移液器小心吸取上清液置冻存管-20℃冰箱保存，待检。

1.2.3 检测步骤 严格按照检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 统计学处理 用SPSS18 进行统计学分析，各组间采用单因素方差分析，各组数据均用±s 表示，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

与Ⅱ组相比较，Ⅲ组血清TIgE 水平降低(P＜0.05);与Ⅱ组相比较，Ⅲ组血清IL-4 水平降低(P＜0.05);与Ⅱ组相比较，Ⅲ组血清IL-5 水平降低(P＜0.05)。见表1 。

表1 小鼠血清TIgE、IL-4 及IL-5 水平 (，n=5)

表1 小鼠血清TIgE、IL-4 及IL-5 水平 (，n=5)

注:与Ⅰ组比较，①P＜0.05;与Ⅱ组比较，②P＜0.05

3 讨 论

过敏性哮喘是一种气道慢性非特异性炎性反应性疾病［8］，它与非过敏性哮喘的主要区别在于体内IgE 水平不同。IgE 被认为是介导Ⅰ型超敏反应的重要介质，促使嗜酸性粒细胞(Eosinophils，Eos)向局部游走，导致呼吸道平滑肌收缩、黏膜水肿、分泌物增加、管腔狭窄等一系列反应。而IL-4 是Th2细胞分泌的促进IgE 合成的最主要细胞因子，与IgE水平升高呈显著正先关，可使静止B 细胞表达FcεR，辅助变应原特异性B 淋巴细胞增殖分化，并通过IgE 类别转换等机制产生变应原特异性IgE，还能促进巨噬细胞的增殖分化，同时也是肥大细胞生长因子。过敏性哮喘以自分泌方式促进Th2 细胞分化，抑制Th1 细胞增殖及其应答;增加血管细胞黏附分子(VCAM)的表达，诱导上皮细胞产生内毒素，促进气道炎性反应，通过STAT-6 通路促肺成纤维细胞分化［9］;也能增强IL-5 促Eos 分化、向气道浸润，诱导Eos、T 细胞等在气道聚集。作为Eos 最重要的活化因子之一的IL-5，对Eos 在呼吸道的活化、聚集、浸润，抑制Eos 凋亡，导致Eos 增多和呼吸道炎性反应持续存在等方面，均起了重要的正向调控作用;协同IL-4 促进IgE 合成;增强血小板激活因子(PAF)和白三烯B4(LTB4)对Eos 的趋化作用。因此血清IgE、IL-4 及IL-5 水平检测是反映哮喘炎性反应程度的敏感、快速的指标。

与Ⅰ组相比较，Ⅱ组及Ⅳ组小鼠血清TIgE、IL-4及IL-5 表达均升高，差异有显著性(P＜0.05)，符合过敏性哮喘发病的特点，也符合旋毛虫感染的特点。Ⅲ组小鼠与Ⅱ组小鼠相比较，TIgE、IL-4 及IL-5 表达均降低，差异有显著性(P＜0.05)，Ⅳ组与Ⅱ组小鼠相比较，TIgE、IL-4 及IL-5 表达无显著性差异(P＞0.05)，提示虽然小鼠感染旋毛虫与诱发过敏性哮喘同样存在IgE 水平升高，Th2 反应亢进的现象，但旋毛虫感染对诱发哮喘时TIgE、IL-4 及IL-5 的表达有抑制作用，此结果与寄生虫感染对过敏有一定的缓解和抑制作用的观点相符［10，11］。

旋毛虫感染或其他蠕虫感染，可诱导宿主的Th2 型免疫应答，与过敏性哮喘同样存在Th2 反应偏移的现象，但却对哮喘有抑制作用，分析其中的影响机制之一可能与旋毛虫感染诱导产生的抗旋毛虫特异性IgE 对变应原特异性IgE 有抑制作用等有关。其次，小鼠感染旋毛虫的免疫反应中还启动了多种细胞调节因子，可能与缓解过敏反应有关，IgE水平的下调也可能与其产生的细胞因子及其他相关细胞因子有关;此外旋毛虫的可溶性抗原物质及宿主产生的刺激分泌物对免疫系统都可产生相应的作用。虽然目前多数研究支持感染寄生虫对过敏反应的发生发展有一定的抑制作用，但具体的影响机制尚未有定论，其具体作用途径、免疫机制仍需进一步探讨。

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