微生物法测定维生素饮料中的维生素B12

陈亚波，周 敏，杨 彤

(中山市质量计量监督检测所广东省质量监督食品检验站(中山)，广东中山 528403)

维生素B12又称钴胺素或氰钴素，是由含钴的卟啉类化合物组成的B 族维生素，深红色针状晶体，结构性质稳定。在中性溶液中耐热，而酸、碱、日光、氧化剂和还原剂均能使其破坏。目前，维生素B12有多种检测方法，包括微生物检测法［1-4］、高效液相色谱法［5-7］、原子吸收分光光度法［8］、化学发光分析法［9］、酶联免疫法［8］、液相色谱-质谱仪法［10］等。对于维生素饮料等功能性饮料，国家标准是采用高效液相色谱法，但由于仪器灵敏度不够、干扰较大等原因，高效液相色谱法的应用受到很大的限制。微生物法则由于其高灵敏度及可靠性已得到国际上权威机构的广泛认可。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

生化培养箱 (上海一恒);高压灭菌器(Hirayama，日本);密封培养罐(北京路桥);pH计(奥立龙，美国);离心机(HETTICH，德国);紫外可见分光光度计(VARIAN，美国);旋涡混合器(IAK，德国)。

莱士曼氏乳酸杆菌(ATCC 7830，美国);维生素B12标准品(国家标准物质研究中心);MRS肉汤(北京路桥);哥伦比亚CNA 琼脂(北京路桥);无菌脱纤维羊血(北京路桥);CO2产气袋(三菱瓦斯，日本);乳酸杆菌琼脂培养基(BD，美国);乳酸杆菌肉汤培养基(BD，美国);维生素B12测定用培养基(BD，美国)。

1.2 标准溶液的制备

1.2.1 维生素B12贮备液(10 μg·mL-1)

精确称取维生素B12标准品10 mg，用25%乙醇定容至1 000 mL，储存于冰箱内，保存期3个月。

1.2.2 维生素B12中间液(100 ng·mL-1)

用25%乙醇溶液将20 mL 维生素B12贮备液定容至200 mL，储存于冰箱内，保存期3个月。

1.2.3 维生素B12工作液(1 ng·mL-1)

用25%乙醇溶液将2.0 mL 维生素B12中间液定容至200 mL，储存于冰箱内，保存期3个月。

1.2.4 标准曲线工作液

分别吸取5 mL 维生素B12工作液于250 和500 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，浓度分别为0.02，0.01 ng·mL-1，临用前配制。

1.3 测试菌液的制备

1.3.1 莱士曼氏乳酸杆菌冻干菌株的活化

无菌条件下，将冻干菌株开封后，接种于MRS 肉汤中，35℃，正常环境培养48 h，然后接入含羊血的哥伦比亚CNA 培养基中，35℃下5%CO2环境培养48 h。

1.3.2 测试菌液制备

将活化后的莱士曼氏乳酸杆菌接种到乳酸杆菌琼脂斜面上，(36 ±1)℃培养24 h，再转接2～3代以增强活力。转接到乳酸杆菌肉汤培养基中，(36 ±1)℃培养18～24 h 后，2 000 r·min-1离心3 min，弃上清液，加入10 mL 0.9%生理盐水，混匀，再离心。如前操作，再清洗2 次，制成菌悬液。吸取适量该菌悬液于10 mL 0.9%生理盐水中，混匀制成测试菌液。用紫外可见分光光度计，以0.9%生理盐水做空白，在550 nm 波长下测定测试菌液的透光率，调节加入菌悬液的量，使测试菌液的透光率60%～80%。

1.4 样品前处理

称取1.3 g 无水磷酸氢二钠，1.0 g 无水偏重亚硫酸钠，1.2 g 柠檬酸(含1个结晶水)，用100 mL蒸馏水溶解。取适量样品于三角瓶中，用10 mL 上述溶液混合，加150 mL 蒸馏水，用铝箔纸封口，121℃水解10 min，冷却后调pH 值至4.5±0.2，再用蒸馏水定容至250 mL，过滤。移取滤液5 mL，加入20～30 mL 蒸馏水，调pH 值至6.8 ±0.2，用蒸馏水定容至100 mL，为样品处理液，备用。

1.5 标准曲线的制备

按表1 顺序依次加入蒸馏水、标准曲线工作液和维生素B12测定用培养基于试管中，1 式3 份，反应体系均为10 mL。

表1 标准曲线的制备

1.6 待测液的制备

依次加蒸馏水、样品处理液和维生素B12测定用培养基于试管内，1 式3 份，反应体系为10 mL(表2)。

表2 待测液的制备

1.7 灭菌及接种培养

将所有试管盖上试管帽于121℃灭菌5 min。灭菌完毕，将试管取出后在冷水浴中迅速冷却至30℃以下。用移液器向上述试管中各加50 μL 测试菌液，混匀，其中标准曲线管中S1除外。S1不接种菌液为不接种空白，S2接种菌液为接种空白。将所有试管放入生化培养箱内，(36 ±1)℃培养19～20 h。

1.8 测定方法

培养结束后，未接种空白试管S1内培养液应澄清，标准曲线管和试样管中培养液的浊度应有梯度。以接种空白管S2作对照，在550 nm 波长下测定最高浓度管S10的吸光度，每隔2 h 进行测定。若2 次结果吸光度差值小于2 %，则取出全部试管测定吸光度。用未接种空白管S1作空白，调紫外可见分光光度计吸光度到0，读出接种空白管S2的读数。再以接种空白管S2为空白，调节吸光度为0，读出其他每支试管的吸光度。

测定时，每支试管用涡旋混合器充分混合后，立即将培养液移入比色皿，读出吸光度。以维生素B12标准品的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作标准曲线。根据待测液的吸光度，从标准曲线中查得该待测液中维生素B12的浓度，再根据稀释因子和样品量计算出试样中维生素B12的含量。

2 结果与分析

2.1 维生素B12的标准曲线

根据维生素B12标准系列管的吸光度平均值绘制标准曲线(图1)。维生素B12含量在0.01～0.10 ng范围线性关系良好。线性回归方程为y=5.993 2x-0.056 8，相关系数R2=0.996 6。因此，可据此计算出样品中维生素B12的含量。

2.2 方法的精密度

将3种不同品牌的维生素饮料各自取平行样2份，测定维生素B12含量，按照国家标准方法要求，计算精密度(表3)，精密度均小于10 %，符合标准要求。

表3 精密度试验结果

2.3 方法的重复性

对同一维生素饮料样品按照本法进行10 次测定，进行重复性试验(表4)。10 次测定的平均值为1.399 μg·L-1，相对标准偏差为0.738 0%。相对标准偏差小于2%，测定数据准确可靠，方法重复性好。

表4 重复性试验结果

2.4 方法的准确度

对3种饮料进行回收率试验(表5)。取已知维生素B12含量的样品，再加入一定量的标准溶液，按照样品处理方法，进行一系列的操作。回收率均达到96.5%以上，方法准确度高。

表5 试样加标回收试验

3 小结

本试验采用微生物法测定维生素饮料中维生素B12含量，方法灵敏度高，测定结果准确可靠，方法精密度高，值得经常进行维生素检测的实验室应用推广。但是，微生物法在很多方面依然不易掌握，在检测过程中应谨慎对待，保证每一步操作符合要求，具体注意以下几个方面。

准备玻璃仪器时，使用活性剂对玻璃试管及其他必要的玻璃器皿进行清洗，清洗之后200℃干热2 h，以除去微量生长因子、洗涤剂残留及某些微生物产生的维生素等。

菌种的复苏与活化一定要按照该菌种的要求严格进行，否则测定中菌种会生长不好，且一定要注意无菌操作避免污染。

试管灭菌时应留有适当的间隙，以保证灭菌过程条件一致，灭菌结束应迅速取出冷却，避免有色物质产生。

取样前，应根据其标示值估算取样量，以保证样品稀释后的维生素浓度尽量被标准溶液系列浓度所覆盖。

每次试验过程各种条件应尽量保持一致，以保证标准曲线的代表性和有效性、试验的重复性及符合精密度要求。

［1］GB 5413.14—2010 婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定［S］.

［2］张玉杰，吕为群，殷晓红.奶基婴幼儿食品中维生素B12活性测定:微生物分析法［J］.生物技术，1993 (8):39-43.

［3］张丽宏，王克新，王淼，等.微生物法测定乳粉中维生素B12的应用和探讨［J］.中国乳品工业，2008，10 (215):58-60.

［4］高星，许国庆.微生物法分别测定配方奶粉中的维生素B5及B12［J］.中国乳业，2003 (6):31-33.

［5］GB/T 5009.217—2008 保健食品中维生素B12的测定［S］.

［6］周迅雷，褚庆环，张志国，等.高效液相检测婴儿配方乳粉中的维生素B12［J］.食品工业科技，2009 (6):330-332，335.

［7］李红艳，王瑾，邵亮亮，等.固相萃取高效液相色谱法测定功能性饮料中微量维生素B12［J］.浙江农业科学，2012 (3):384-386.

［8］杨祖英.食品安全检测手册［M］.北京:化学工业出版社，2009.

［9］Fumio Watanabe，Shigeo Takenaka.Comparison of a microbiological assay and a fully automated chemiluminescent system for the determination fo vitamin B12in food ［J］.Agric Food Chemistry，1998，46 (6):1433-1436.

［10］徐双阳，许荣年，汪庆旗，等.超高效液相色谱-质谱联用测定婴幼儿配方奶粉中的维生素B12［J］.食品工业，2011 (8):103-106.