PDTC 关节腔注射对兔创伤性OA 软骨MMP-1、MMP-9 mRNA 表达的影响

董 刚 乐 军 周 辉 项 东 杭州市中医院骨伤科 杭州310007

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种最普遍的关节疾病，它所带来的疼痛、关节功能障碍，严重影响患者的生活质量，目前仍缺乏有效的治疗措施。基质金属蛋白酶（MMPs）因能降解几乎所有的软骨细胞外基质而被认为在OA 发病过程中起重要作用，是降解细胞外基质的主要酶系，而核因子-κB（NF-κB）则是介导OA 软骨中各种不利因素对MMPs 基因表达调控的最重要的转录因子。近年研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）能够明显抑制实验模型中NF-κB的激活，阻断其下游靶基因的表达，发挥对组织器官良好的保护作用，展示了PDTC 机体应用的良好前景。本实验旨在观察PDTC 关节腔注射对兔创伤性OA 软骨组织MMP-1、MMP-9mRNA 表达及NF-κB 激活的影响，探讨PDTC 机体应用预防、延缓创伤性OA 进展的可行性。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 PDTC（美国Sigma 公司），Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司）；逆转录酶Rtase，dNTP，RNA 酶抑制剂，Taq 酶，随机寡核苷酸引物（日本TaKaRa 公司）；PCR Marker（美国Fermentas 公司）；NF-κBp65 免疫组化试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.2 分组造模与处理 健康6月龄纯种新西兰大白兔20 只，由浙江中医药大学实验动物中心提供，雌雄各半，体质量2.4～2.8kg。3%戊巴比妥钠麻醉，两组行右膝横断前交叉韧带术（ACLT），并行抽屉实验确认，术后4天肌注青霉素40 万U/（kg·d）预防感染，术后1 周随机分为对照组和PDTC 组，各10 只。PDTC 组关节腔注射PDTC（1mg/mL），1 次2mg，每周2 次，连续8 周；对照组同一时间点关节腔注射等容量生理盐水。白兔不作固定，分笼饲养，术后1 周强迫白兔活动30min/d，持续2 周，末次用药3天后处死白兔。

1.3 观察指标 观察膝关节积液、滑膜肿胀情况，并于解剖显微镜（10 倍）下观察股骨内髁软骨退变情况，按以下标准评分：0 分，关节面光整，色泽如常；1分，关节面粗糙，有小的裂隙且色泽灰暗；2 分，关节面糜烂，软骨缺损达软骨表中层；3 分，关节面溃疡形成，缺损达软骨深层；4 分，软骨剥脱，软骨下骨质暴露。

1.4 RT-PCR ①引物设计与合成：检索NCBI GenBank 数据库中兔MMP-1、MMP-9的全长mRNA序列，应用primer premier 5.0 软件设计MMP-1、MMP-9 和内参照β-actin的上下游引物序列，见表1。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。②总RNA 提取：取股骨内髁退变区软骨组织置于1mL Trizol 液中匀浆，参照Trizol 试剂盒说明书提取总RNA，以紫外分光光度计测定A260/A280 比值≥1.8 控制总RNA 纯度。③mRNA 逆转录产生cDNA 第一链：采用20μL 逆转录反应体系，依次加入5×M-MLV 逆转录酶缓冲液5μL，M-MLV 逆转录酶1μL，10 mmol dNTP 1.25μL，RNAase 抑制剂1.6μL，Oligdt（50pM）2μL，DEPC 去离子水补至20μL，充分混均后42℃反应60 min，95℃灭活逆转录酶5min。冰浴10 min，完成cDNA 链合成。④PCR 扩增：反应体系为50μL，包含cDNA 10μL，10×PCR 缓冲液5μL，10mmol/L dNTP 1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA 聚合酶2U。扩增条件：94℃预变性5min 后，94℃变性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸1min，反应30个循环，最后一轮72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物取18μL目的基因在1.5%琼脂糖上电泳，紫外灯下观察结果并照相，吸光度扫描仪扫描后PCR 条带用软件进行定量分析，结果为基因表达量对β-actin 内参的比值，以上结果重复三次，取平均值。

表1 MMP-1、MMP-9、β-actin 引物序列

1.5 免疫组化 4μm 组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3% H2O2（过氧化氢）室温孵育10min，微波修复抗原10min，温度92℃～98℃，10%正常山羊血清封闭，室温孵育10min，鼠抗兔NF-κBp65 血清工作浓度1：100，4℃孵育过夜，生物素标记二抗37℃孵育20min，辣根酶标记链霉卵白素37℃孵育20min，DAB（三氨基联苯二胺）显色，自来水充分冲洗，复染，封片。用磷酸盐缓冲液代替一抗作为阴性对照。软骨切片随机选取6个高倍镜视野（400 倍），其中3个位于软骨表层和中上层，另3个位于软骨中下层和下层。计算每个视野中胞核、胞质阳性细胞数及细胞总数，NF-κB 活化程度用NF-κBp65 活性系数表示，即NF-κBp65 胞核阳性百分率与胞质阳性百分率的比值。每张切片的细胞计数分别由两个独立的观察者进行，其评分误差率控制在5%以内，取两者均值为最后数值。

2 结果

2.1 形态学观察 两组多数样本可见滑膜炎表现，软骨退变主要位于股骨内髁内侧。对照组软骨膜、软骨出现糜烂缺损，有溃疡形成，甚至可见软骨下骨；PDTC 组关节面色泽灰暗，软骨膜、软骨出现糜烂缺损。PDTC 组软骨退变明显轻于对照组（P＜0.05）。两组形态学评分见表2。

表2 两组形态学评分比较 只

2.2 两组软骨MMP-1、MMP-9mRNA 表达 MMP-1、MMP-9、β-actin的RT-PCR 产物电泳结果见图1（封二），PDTC 组MMP-1、MMP-9mRNA 表达量均低于对照组（P＜0.01），见表3。

2.3 软骨NF-κBp65 蛋白表达 NF-κBp65 免疫组化，NF-κBp65 阳性细胞胞质或（和）胞核均呈棕黄色颗粒，阴性对照仅见背景着色，对照组软骨四层均阳性胞核强烈表达，PDTC 组阳性胞核在软骨四层中亦散在表达，但表层、中上层表达更为明显，见图2（封二）。PDTC 组NF-κBp65 活性系数明显低于对照组（P＜0.01），见表3。

图1 MMP-1、MMP-9、β-actin 电泳图。

图2 软骨NF-κBp65 表达，DAB 染色×400

表3 两组MMP-1、MMP-9mRNA 表达量及NF-κBp65 活性系数比较（）

表3 两组MMP-1、MMP-9mRNA 表达量及NF-κBp65 活性系数比较（）

注：与对照组比较，△P＜0.01

3 讨论

3.1 MMP-1、MMP-9 及NF-κB 信号通路在OA 软骨组织的表达 MMP-1 是OA 发病机制中极其重要的胶原酶，其作用底物主要是I、II、III 型胶原和蛋白多糖，MMP-1 是OA 软骨中表达水平最高的胶原酶，这样在对II 型胶原的降解中MMP-1 表达量上的绝对优势弥补了其相对于其他胶原酶的低效率，使MMP-1 在启动OA 软骨基质II 型胶原降解，影响II型胶原降解速率方面起到了主导性作用[1]。MMP-9是明胶酶中的一个重要元素，可将胶原酶变性裂解的II 型胶原进一步裂解，并对IV、V、VII 型胶原、明胶等小分子基质成分有降解作用。Li 等[2]通过对109例OA 患者的血生化检测证实，OA 患者血清MMP-9表达水平明显升高，且其敏感性、特异性较高，因此在OA 早期阶段影像学不足以反映软骨退变的情况下，通过对血清MMP-9 表达水平的检测可对OA 进展作出病理学预测。NF-κB 则是OA 软骨中重要的转录因子，以p50/p65 异二聚体为主要存在形式，当细胞受到IL-1β 等细胞因子刺激时，滞留于胞浆中的p50、p65 亚基在入核引导序列的作用下进入胞核内，与靶基因增强子顺式元件κB 序列结合，启动靶基因的表达，目前的研究已经证实在细胞因子诱导培养的软骨细胞以及OA 软骨细胞中存在NF-κB 系统的过量激活[3]。因此以NF-κB 为靶点，抑制NF-κB激活的治疗策略受到越来越多学者的关注[4]。

3.2 软骨组织NF-κB 信号通路与MMP-1、MMP-9基因表达的关系 MMP-1、MMP-9的基因启动子区域包含典型的NF-κB 结合位点，NF-κB的激活对于它们的转录可能是必需的。Toegel 等[5]在研究苏木提取物对IL-1β 诱导培养人关节软骨细胞的作用时，发现其不仅能够明显抑制软骨细胞中NF-kB 启动子的激活，而且明显抑制软骨细胞中MMP-1、MMP-9mRNA 表达，这在一定程度上说明了在人关节软骨细胞中NF-kB 可能是MMP-1、MMP-9 基因的上游转录因子。Lu 等[6]研究同样显示在细胞因子诱导培养的软骨肉瘤细胞中，NF-κB 信号通路可能直接或间接的参与了对MMP-1、MMP-9 基因表达的调控。而本实验发现PDTC 关节腔注射能够明显抑制OA软骨中NF-κB的激活以及MMP-1、MMP-9 mRNA的表达，一定程度上说明在OA 软骨中NF-κB 激活直接或间接参与对MMP-1、MMP-9 基因表达的调控。

3.3 PDTC 机体应用的可行性 PDTC 是一种抗氧化剂，主要作用于IκB 降解的上游环节（IκBα 磷酸化或IKK 活性水平），是转录因子NF-κB的特异性抑制剂。通过抑制NF-κB 活性来抑制下游相关基因的表达已成为近年来的研究热点。如急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征时伴随着肺组织中NF-κB的过量激活，以及肿瘤坏死因子（TNF-α）、胞间黏附分子1（ICAM-1）等炎性细胞因子的大量释放，进而导致肺炎性损伤、肺功能下降[7]。而应用PDTC 静脉注射干预急性肺损伤模型后，能够明显抑制NF-κB的激活，以及反映肺损伤程度的TNF-α 等炎性细胞因子的过量表达，从而有效改善肺功能[8]。而本实验显示，PDTC 组软骨组织MMP-1、MMP-9mRNA 表达水平明显低于对照组（P＜0.01），PDTC 组软骨退变明显轻于对照组（P＜0.05）。PDTC 在动物模型研究中的良好效果，可能与PDTC 能够选择性地抑制NF-κB 激活，抑制炎性细胞因子等NF-κB 下游基因的表达有关，而目前的动物模型实验中未见PDTC 干预对动物模型毒性的报道，展示了PDTC 机体干预应用的良好前景。

本实验通过对创伤性兔OA 模型行关节腔注射PDTC，发现PDTC 能够明显抑制OA 软骨中NF-κB信号通路的激活以及MMP-1、MMP-9mRNA 表达，一定程度上减缓、抑制OA 软骨退变的进程，为OA治疗提供了新的临床靶标。鉴于PDTC 是NF-κB 特异性抑制剂，对MMP-1、MMP-9 基因表达无直接性抑制作用，笔者认为NF-κB的过量激活参与了OA病程的发展，而PDTC 对MMP-1、MMP-9 基因表达的抑制作用正是通过抑制NF-κB的激活而实现，提示在OA 软骨中NF-κB的激活，直接或间接地参与了对MMP-1、MMP-9 基因表达的调控。

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