口疡清方对复发性口腔溃疡模型大鼠免疫功能的研究*

孙勤国 江 波 崔晓燕 张贤梅 徐鸿婕

武汉市第三医院中医科，武汉 430060

·实验研究·

口疡清方对复发性口腔溃疡模型大鼠免疫功能的研究*

孙勤国 江 波 崔晓燕 张贤梅 徐鸿婕

武汉市第三医院中医科，武汉 430060

目的研究口疡清方对复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer，ROU)模型大鼠免疫功能的影响，探讨该方对ROU的预防和治疗作用。方法①用免疫法建立大鼠ROU模型，并用口疡清方行早期预防和模型成功后治疗；②用流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测各组大鼠外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞比例。结果模型大鼠CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞均下降，而口疡清方的早期预防和后期治疗均可以明显提高相应的比例，差异有统计学意义(Plt;0.05)。结论口疡清方可以解除ROU的免疫抑制状态，增强模型大鼠的免疫功能，对ROU具有防治作用。

口疡清方； 复发性口腔溃疡； 流式细胞术； T细胞亚群

复发性口腔溃疡(recurrent oral ulcer，ROU)又称复发性阿弗他溃疡(recurrent aphthous ulcer，RAU)或复发性阿弗他口炎(recurrent aphthous stomatitis，RAS)，是一种好发于唇、舌、颊、软腭等部位，具有周期性、复发性、自限性特征的口腔黏膜疾病[1]。ROU发病机制复杂，临床表现迁延难愈，目前尚无特殊药物治愈。中医“未病先防，既病防变”思想为ROU预防和治疗提供思路，本研究拟探讨口疡清方对ROU的预防和治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选取SPF级雄性SD大鼠22只，体重180～200 g，购买于武汉大学动物实验中心[SCXK(鄂)：2008-0004]，喂养于武汉大学中南医院动物中心。

1.2 主要试剂和仪器

口疡清方(当归12 g，生地、丹皮、紫草、藿香各10 g，升麻、黄连、甘草各6 g)由本科自拟，药剂科煎制。PITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8单克隆抗体(联科生物)；红细胞裂解液(碧云天生物技术研究所)；流式细胞仪(美国DB公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 ROU模型的制备及分组 将购买的大鼠适应性喂养3 d，无菌条件下取口腔黏膜，PBS匀浆后，与完全弗氏佐剂按1∶1的比例制备成抗原乳化剂，用玻璃棒搅匀约20 min，直至滴入水中1 min内不散开。将制备好的抗原乳化剂注射SD大鼠背部，注射时先用剪刀剪去被毛，用75%酒精消毒注射部位皮肤，每次注射2～3个点，每点注射0.1 ml，每周1次，连续7周。模型的建立与成功标准参考文献[2-3]。

随机分组：正常对照组5只，正常饮食，不给予任何药物；模型组5只，建模成功后不给予任何药物干预；预防组6只，自第1次免疫注射时就给予口疡清方，按照人与大鼠的比例计算，每天4.2 g/kg灌胃预防给药，直至处死取材；治疗组6只，建模成功后给药，每天4.2 g/kg灌胃治疗给药。各组大鼠药物干预15 d后，用10%的水合氯醛麻醉后取眼眶后静脉血。

1.3.2 流式细胞术检测外周血T细胞亚群 标记高压灭菌离心管，分别取100 μl抗凝外周血，各管先后分别加入10 μl PITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8三种染色试剂。另外取3管正常组抗凝血100 μl分别加入PITC-CD3、APC-CD4、PE-CD8，取1管正常组抗凝血不加入任何抗体标记，作对照和设门参照，每管10 μl，37 ℃孵育30 min，取出后每管加入1.5 ml红细胞裂解液，室温下孵育45 min后，3 min，1 200 rpm离心，倒掉上清液，再用PBS清洗2～3次，直至离心管内为透明色，最后用500 μl PBS重悬，过滤后上机检测。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 一般观察

实验期间大鼠饮食无明显变化规律，免疫注射后大鼠精神状态及活动较正常组稍差，抓取时易于反抗。每次注射后第3天注射点开始出现溃疡，大小不均，最大达0.8～1.0 cm，注射点有相互融合现象，溃疡愈合后形成疤痕，第3次免疫注射后牙龈和口腔黏膜开始出现充血，第4次注射后下牙龈出现红黄相间的黏膜改变，有接触性出血，于第6次注射后出现溃疡，大小、部位不一；口疡清方治疗后，溃疡面面积缩小，部分溃疡点消失，口腔黏膜红润。见图1。

A：第4次免疫注射时大鼠背部溃疡改变；B：第6次注射后口腔黏膜变化(模型)；C：口疡清方干预后口腔黏膜变化

2.2 流式细胞术检测T细胞亚群的比例

建模后外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞均有所下降，真正代表辅助/诱导性T淋巴细胞CD3+CD4+和真正代表CD8+T淋巴细胞的CD3+CD8+下降幅度较混有单核细胞、NK及少许粒细胞的CD4+、CD8+稍低，且CD3+CD4+/ CD3+CD8+较正常组低，说明免疫法建立的ROU大鼠模型免疫功能存在抑制状态。通过口疡清方的早期预防和后期治疗可以明显改善这种抑制状态，两组总体T淋巴细胞较模型组有明显上升(P= 0.012，0.049)，差异有统计学意义(Plt;0.05)。说明口疡清方可以在一定程度上解除由免疫佐剂制备的口腔黏膜蛋白抗原诱导的免疫损伤，促进口腔黏膜的愈合，对ROU有预防和治疗作用。见表1。

3 讨论

复发性口腔溃疡中医称“口疮”、“口疳”、“口糜”等，主要因饮食厚味、劳倦内伤、情志失调等导致上焦实火熏灼、下焦阴火上炎、中焦虚寒或脾虚湿困等引起。清朝齐秉惠《齐氏医案·口疮》认为：“口疮上焦实热，中焦虚寒，下焦阴火，各经传遍所致，当分辨阴阳虚实寒热而治之”。孔燕[4]则从脏腑论治该病，认为心火上炎证用泻心导赤散加减，心脾积热证用清热泻脾散加减，肝郁化火证用龙胆泻肝汤加减，肝郁脾虚证用逍遥散或丹栀逍遥散加减，肺胃蕴热证用枇杷清肺饮加减，脾胃湿热证用茵陈蒿汤合三仁汤加减，脾胃气虚证用补中益气汤加味，阴虚火旺证用知柏地黄丸加减，脾肾阳虚证用附子理中丸加减。

表1 流式检测T细胞亚群比例

与模型组比较*Plt;0.05

口疡清方以当归、生地为君药，补血养阴生津，以黄连、丹皮、紫草为臣药，清气、血分虚实之热，佐以藿香化湿，使以甘草调和诸药，并以升麻引药上行，升清降浊，全方养阴清热，泻火解毒，兼顾化湿，使湿热之邪得以清散，清阳得以升举。方剂中药用成分早前已有研究[5-6]认为，当归中当归多糖是当归免疫促进功能的主要成分，能促进小鼠非特异性免疫反应，显著促进免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力，并主要促进细胞免疫。现代研究[7-9]认为，当归内酯对小鼠的免疫功能有一定的重构作用，当归多糖和生地也能明显促进外周血T 淋巴细胞增殖。

T细胞是淋巴细胞的主要组分，它具有多种生物学功能，T细胞的细胞免疫作用可释放多种淋巴因子，最终使机体免疫效应增强。CD3、CD4、CD8 是T细胞膜表面特异性抗原，CD3+代表全T淋巴细胞，它包括T辅助/诱导T细胞(CD4+)和T抑制/细胞毒T细胞(CD8+)，CD3+CD4+代表 T辅助/诱导细胞亚群，CD3+CD8+代表 T抑制/细胞毒性细胞亚群，CD3+CD4+/ CD3+CD8+代表 T辅助细胞/T抑制细胞的比值，通过测定各个比例可以反应机体的免疫功能状态[10]。本实验采用免疫法建立ROU大鼠模型，研究口疡清方对ROU大鼠模型早期预防及溃疡期形成后的治疗作用。以流式细胞术检测外周血T细胞亚群统计结果分析，认为模型组比正常组的CD3+、CD4+、CD3+CD4+/ CD3+CD8+均有减少，这与之前关于ROU免疫功能异常的研究结果是一致的[2-3]，口腔溃疡出现的时间较参考模型晚，分析可能与免疫佐剂中卡介苗的含量有关，结果还显示，前期预防组和后期治疗组的相应比例增加，说明口疡清对ROU模型大鼠的免疫抑制解除有一定的作用。口疡清方对ROU模型大鼠具有防治作用，但其具体免疫途径及分子机制有待于进一步深入研究。

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EffectofKouYangqingPrescriptionontheImmunologicFunctionofRatswithRecurrentOralUlcer

SUN Qinguo,JIANG Bo,CUI Xiaoyan,et al

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,WuhanNo.3Hospital,Wuhan430060,China

ObjectiveTo study the effect of Kou Yangqing prescription on the immunologic function of rats with recurrent oral ulcer.Methods①Using immune method to establish ROU rats model，and using Kou Yangqing prescription to early prevent and treat after the model successfully made ;②Using FCM to detect the peripheral blood level of CD3+，CD4+，CD8+T lymphocytes in each group.ResultsThe CD3+、CD4+、CD8+of T lymphocytes in model group has declined as compared with the control group，however，the early prevention and post-treatment can significantly improve the corresponding proportion of T lymphocytes(Plt;0.05).ConclusionThe Kou Yangqing prescription can relieve the immunosuppressive state and enhance the immune function of rats with ROU.

Kou Yangqing prescription；ROU； FCM；T cell subpopulation

10.3969/j.issn.1674-4616.2013.02.004

*武汉市卫生局临床医学科研项目(No.WZ12A02)

2013-02-11)