水蛭提取物对人白血病HL60细胞体外抑制作用研究*

★ 肖移生 廖夫生 赵志冬 左爱仁 朱大诚

（江西中医学院 南昌 330004）

水蛭俗称蚂蝗，性咸、苦、平，归肝经，有破血、逐瘀、通经等功效，用于治癥瘕、痞块、血瘀闭经、跌打损伤等，其药理作用为抗凝、溶栓、抗血小板及降血脂等[1]；临床上水蛭也可单方或组方运用于肿瘤治疗中[2]。但现有的研究、应用水蛭治疗肿瘤是抗实体肿瘤，然而水蛭是否具有抗血液系统肿瘤的作用目前尚未见相关文献报道。因此，我们采用HL-60细胞作为髓系白血病研究的工具细胞，探讨水蛭提取物对其体外抑制作用。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养方法

HL60细胞由江西中医学院基础医学院实验中心保存，将HL60细胞培养于含有10%新生小牛血清的RPMI1640完全培养基中（37℃，5%CO2饱和湿度培养），培养至细胞处于对数生长期用于后续实验。

1.2 主要试剂

RPMI1640培养基及新生小牛血清为美国GIB-CO公司产品，四甲基偶氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）为美国Sigma公司产品。

1.3 药物

水蛭原药材购于江西中医学院附属医院中药房，并经我校中药生药教研室鉴定且符合国家中药临床应用标准。水蛭用超微粉碎机粉碎，提取物以液氮快速冻融法制备[3]：取水蛭超微粉1.5g置15mL离心管内，加10mL无菌双蒸水制成混悬液，再将离心管置液氮内5min，取出，立即放入37℃水浴中迅速融解，重复3次，再3 000 r/min离心10min。取上清液过滤，滤液冷冻干燥18h即得水蛭冻干粉，-20℃保存备用，临用前用培养基配成实验所需浓度工作液，再经0.22μm无菌滤器正压过滤除菌。

1.4 HL60细胞生长曲线绘制

取对数生长期的细胞接种于25mL的培养瓶，接种浓度为1.0×105/mL，每瓶培养液为4mL，根据预试验结果，实验组加入0.05、0.1、0.5、1.0mg/mL浓度的水蛭提取物连续处理，对照组不加药；每隔24h随机取样，台盼蓝染色法计数活细胞（同一处理计数10瓶细胞取平均值），光镜下计数活细胞数，以时间为横坐标，每毫升活细胞数为纵坐标绘制生长曲线。

1.5 MTT试验

取对数生长期的HL60细胞以5.0×104/mL细胞浓度置于96孔培养板内培养，同时用水蛭提取物（终浓度0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/mL）再处理HL60细胞48h，同时设对照孔，到时间点后各孔加入MTT液20μL/孔，每次10复孔，4h后终止培养，以1 000r/min离心5min，去除上清，加入DMSO（150 μL/孔）使结晶物溶解，用自动酶标仪波长490nm处测吸光度A值，实验重复5次，得出量效关系。按下列公式计算细胞抑制率：细胞生长抑制率（%）=（对照孔A值-试验孔A值）／对照孔A值×100%。根据不同药物浓度条件下细胞生长抑制率数值进行相关回归分析，并根据回归方程计算半数抑制浓度（IC50）。以1/2 IC50含药量作为进一步实验起始工作浓度。

1.6 克隆形成试验

根据文献[4]改进集落形成试验，将对数生长期的HL60细胞（1.0×103/mL细胞浓度）、10%新生小牛血清RPMI1640培养液、各浓度水蛭提取物（根据前两项试验结果，设0.7、1.4、2.8mg/mL）和终浓度为0.3%的琼脂充分混匀，正常对照组不加水蛭提取物，然后接种于35mm培养皿中（1.5mL/皿），每组10个皿，置于37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养5d。在终止培养之时，倒置显微镜下计数每皿集落数，≥40个细胞的细胞团为1个集落，结果取平均值。

1.7 Hoechst33342荧光染色检测

各个浓度水蛭提取物（设0.7、1.4、2.8mg/mL）处理HL60细胞48h后，加入终浓度为10μg/mL的Hoechst 33342并于37℃孵育30min，再加入终浓度为1%的多聚甲醛于暗处固定细胞30min。暗处离心弃上清，取细胞涂片并用封片液封片于载玻片上。荧光显微镜下观察结果。在高倍镜下随机计数200个细胞并照相。计算凋亡率：凋亡率（%）=凋亡细胞数÷计数的细胞总数×100%。实验重复10次，结果取平均值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 水蛭提取物对HL60细胞生长的影响

正常对照组细胞经过72h完成对数生长期，然后达到平台期；0.05mg/mL水蛭提取物对细胞抑制不明显；0.1-1.0mg/mL浓度的水蛭提取物对HL60细胞有明显的抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。其中1.0mg/mL水蛭提取物组的细胞增殖缓慢，48h达高峰，随后数量下降，故后续试验取水蛭提取物作用HL60细胞48h为观察时间点。见图1。

图1 不同浓度水蛭提取物对HL60细胞的影响

2.2 水蛭提取物对HL60细胞增殖的抑制作用

各浓度的水蛭提取物处理HL60细胞48h后，MTT检测结果显示水蛭提取物以剂量依赖性方式抑制HL60细胞增殖，抑制率随水蛭提取物浓度增高而增加。0.05mg/mL组与正常组比较无统计学差异，其余各组与正常组比较均有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

运用统计软件计算出水蛭提取物对HL60相关抑制率的相关直线回归方程为y（增殖抑制率）=12.364x（药物浓度）-17.201，经计算作用HL60细胞48h时的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL。故后续试验将水蛭提取物设为0.7、1.4、2.8mg/mL 3个剂量作用HL60细胞48h时间段进行研究。

表1 水蛭提取物处理48h后对HL60细胞增殖抑制作用

2.3 水蛭提取物对HL60细胞系克隆形成的影响

HL60细胞系克隆形成试验结果，正常对照组克隆数为88.4±6.5，用不同浓度的水蛭提取物作用HL60细胞48h，克隆形成明显减少，两者成反比关系，即药物浓度越大，克隆形成越少。各药物组与正常对照组比较均有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

2.4 水蛭提取物诱导HL60细胞凋亡

正常对照组HL60细胞大小一致，形态正常，细胞浆及核内染色质呈均匀蓝色荧光；各药物组可见较多的细胞表现为核染色质凝集致密浓染，荧光增强，细胞核染色质固缩或碎裂成2块以上即为凋亡细胞；各药物组凋亡细胞量较正常对照组明显增多，且呈剂量依赖关系，与正常对照组比较均有统计学差异（P＜0.05，P＜0.01）。见表2、图2。

表2 水蛭提取物对HL60细胞系集落形成及诱导HL60细胞凋亡的影响

3 讨论

水蛭始载于《神农本草经》，有破血、逐瘀、通经等功效，广泛用于心脑血管及血栓性疾病的治疗，水蛭也是肿瘤疾病治疗中常用的一味活血药。现代研究发现水蛭抗肿瘤的主要活性成份有凝血酶抑制剂及蛋白酶抑制剂等，含量中主要是水蛭素、溶纤素等，这些都是小分子肽，对热敏感。不同的提取方法，会极大的影响水蛭药效[5]。本研究采用液氮快速冻融法制备水蛭提取物，这种低温炮制工艺可以有效减少和防止炮制过程中水蛭多肽和蛋白类活性成分的降解与变性失活，从而显著提高了药效[6、7]。

本课题组进行了水蛭提取物抗人白血病HL60细胞体外增殖药效研究，发现水蛭提取物浓度高于0.1mg/mL时对HL60细胞有明显的抑制作用，并呈时间和剂量依赖性。经计算作用HL60细胞48h时的水蛭提取物IC50=1.4mg/mL，故后续试验将水蛭提取物设为0.7、1.4、2.8mg/mL 3个剂量作用HL60细胞48h时间段进行研究。运用克隆形成实验也发现0.7-2.8mg/mL浓度的水蛭提取物作用HL60细胞48h，药物浓度越大，克隆形成越少，克隆形成与药物浓度成反比。这进一步说明水蛭提取物对HL60细胞有明显的抑制作用。

田雪飞等[8]运用MTT检测方法发现水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞有体外抑制作用的范围在3.0-15mg/mL，其作用HepG2细胞48h时的半数有效抑制浓度IC50=6.0mg/mL。运用同样的方法制备水蛭提取物，我们得出水蛭提取物作用HL60细胞48h时的IC50=1.4mg/mL。两者相差较大，可能是细胞不同，对药物的敏感也不同所致。运用Hoechst33342荧光检测结果，0.7、1.4、2.8mg/mL提取物诱导HL60细胞凋亡率分别为18.45±5.25、25.61±7.70、30.38±6.89，说明水蛭提取物有一定的诱导HL60细胞凋亡作用。这也是水蛭提取物对HL60细胞抑制机理之一，但详细机制还需进一步研究。

[1]周乐，赵文静，常惟智.水蛭的药理作用及临床应用研究进展[J].中医药信息，2012，29（1）：132-133.

[2]张娟，张媛.浅谈水蛭在肿瘤疾病中的运用[J].湖南中医杂志，2006，22（4）：69.

[3]郭永良，田雪飞，肖竺.水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞体外抑制作用研究[J].中国中医药信息杂志，2009，16（8）：30-31.

[4]Puissant A，Groaso S，Jacquel A，et al.Imatinib mesylate-resistant human chronic myelogenous leukemia cell lines exhibit high sensitivity to the phytoalexin resvemtroi[J].The Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2008，22（6）：1 894-1 904．

[5]王艳，杨培民，代龙，等.水蛭提取方法及生理活性的研究[J].中国生化药物杂志，2012，33（1）：27-30.

[6]王厚伟.低温炮制工艺对水蛭水溶性蛋白组成及纤溶活性的影响[J].中药材，2007，30（3）：272-275.

[7]周春阳，郑燕林，盛荣，等.不同方法水蛭提取液对体外培养LEC影响的实验研究[J].四川中医，2006，24（7）：12-13.

[8]田雪飞，孙婧，方圆，等.水蛭提取物对肝癌HepG2细胞DNA去甲基化作用研究[J].湖南中医药大学学报，2011，31（9）：8-11.