花椒总生物碱抑菌作用

谢 辉，邵建明，王冠蕾

(承德石油高等专科学校化学工程系，河北承德 067000)

花椒(Zanthoxylum BungeanumMaxim)是芸香科(Rutaceae)花椒属(Zanthoxylumlinn)植物花椒或青椒的成熟干燥果皮，具有温中助阳，散寒燥湿，行气止痛，杀虫止痒和抗氧调味的功能，是我国传统调味料和中药［1］。经测定花椒含有挥发油、生物碱、酰胺、木脂素、香豆素、脂肪酸及黄酮等化学成分［2］。

目前对花椒提取物的药理学活性研究主要集中在其挥发油和生物碱等方面，药理实验证明花椒挥发油具有较强的抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、杀病菌和防霉菌作用，对农业害虫小菜蛾、桃蚜和杨毒蛾等亦有防治效果［3－6］;花椒生物碱在抑制血小板凝集、抗疟疾、镇痛、止痒和抑制口腔致病菌等方面均显示了一定生物活性［7］，这些研究暗示着花椒中化学成分在作为天然药物、化妆品、食品添加剂和生物农药等方面有着广阔的应用前景。本文以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉为受试菌株，对花椒总生物碱的抑菌活性进行研究，以期进一步明确花椒生物碱的抗菌谱，为花椒在医药、食品防腐上的应用提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种

大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉。

1.1.2 培养基

真菌培养基(马铃薯葡萄糖培养基):马铃薯浸出液200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然。

细菌培养基(牛肉膏蛋白胨培养基):牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH7.2 ～7.5。

1.2 方法

1.2.1 花椒总生物碱的提取［8］

市售花椒粉碎后干燥至恒重，称取粉末200 g，加入70%乙醇，料液比1∶10，用稀盐酸调pH至3，60℃冷凝回流提取3 h。过滤后减压回收乙醇，水提液用氨水调pH至9～10，再用氯仿萃取水层至水层对碘化铋钾反应呈阴性，合并氯仿液，减压浓缩后常温晾干得花椒总生物碱1.04 g，用20%甲醇水溶液超声溶解配制成500 mg/mL的花椒总生物碱溶液，过滤除菌后4℃保存备用

1.2.2 滤纸片法测定抑菌圈直径［9］

将活化培养的不同菌种制成菌悬液，然后加入0.2 mL菌悬液至冷却的相应培养平板中，涂布均匀。将直径6 mm滤纸片浸入500 mg/mL的花椒总生物碱溶液中稍晾干后放入培养皿，对照为浸入20%甲醇水溶液的滤纸片，使滤纸片与培养基完全接触。供试菌种平行接种3个培养平板。所有平板置培养箱培养，细菌于37℃培养24 h，霉菌于28℃培养48 h，酵母于30℃培养24 h，取出观察，游标卡尺测量抑菌圈的直径(含滤纸片直径)，求平均值。

1.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定［10］

采用试管二倍稀释法测定最小抑菌浓度，取若干灭菌试管，以适合菌种生长的液体培养基将花椒总生物碱溶液进行一系列对倍稀释，浓度分别为 250，125，62.5，31.25，15.63，7.81，3.91，1.95 mg/mL，同时设空白对照和甲醇溶液对照。加入相应供试菌悬液0.05 mL至各试管。所有试管置培养箱培养，细菌于37℃培养24 h，霉菌于28℃培养48 h，酵母于30℃培养24 h，取出观察判定结果，以含药量低且肉眼观察无可见菌生长的试管含药量为药物对该菌的MIC。

1.2.4 热处理对花椒总生物碱抑菌活性的影响［9］

以大肠杆菌为指示菌，将500 mg/mL花椒总生物碱分别置40，60，80，100℃水浴和121℃湿热条件下，热处理30 min，对照置于25℃，用滤纸片法来测定其抑菌圈直径，试验重复3次。

2 结果

2.1 花椒总生物碱的抗菌谱

花椒总生物碱对供试菌种的抑制作用测定结果如表1所示，从表1中可以看出，花椒总生物碱对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母和黑曲霉均具有一定的抑制效果;对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，对酿酒酵母和黑曲霉的抑制作用稍弱。

表1 花椒总生物碱的抑菌直径

2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定

花椒总生物碱对五种供试菌种的最小抑菌浓度测定结果如表2所示，从表2中可以看出，花椒总生物碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为3.91 mg/mL，对枯草芽胞杆菌的最小抑菌浓度为7.81 mg/mL，对黑曲霉的最小抑菌浓度为15.63 mg/mL，对酿酒酵母的最小抑菌浓度为31.25 mg/mL，这表明花椒总生物碱对细菌的抑制作用较强，对酵母的抑制效果相对较弱。

表2 花椒总生物碱对供试菌的最小抑菌浓度测定

2.3 热处理对花椒生物碱抑菌活性的影响

以大肠杆菌为指示菌，测定不同温度处理后花椒总生物碱的抑菌活性变化如图1所示，由图可知，花椒总生物碱经过不同温度处理后，其对大肠杆菌的抑菌圈直径变化不大，经过121℃湿热处理后仍具有较高的抑菌活性，这表明花椒总生物碱的抑菌活性基本不受温度的影响。

3 结论

借助滤纸片法，以抑菌圈直径大小为评价标准，对花椒总生物碱的抑菌作用进行分析，结果显示花椒总生物碱对细菌，酿酒酵母和黑曲霉具有抑菌作用，表明花椒总生物碱的抗菌谱较宽，花椒总生物碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为3.91 mg/mL，对枯草芽胞杆菌的最小抑菌浓度为7.81 mg/mL，对黑曲霉的最小抑菌浓度为15.63 mg/mL，对酿酒酵母的最小抑菌浓度为31.25 mg/mL。热稳定性实验表明花椒总生物碱的抑菌活性基本不受温度的影响。

［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志:第四十三卷第二分册［M］.北京:科学出版社，1997.

［2］ 毕君，曹福亮.花椒属植物化学有效成分与开发利用研究进展［J］.林业科技开发，2008，22(3):9－13.

［3］ 崔俊，李孟楼.花椒开发利用研究进展［J］.林业科技开发，2008，22(2):9－14.

［4］ 干信，吴士筠，高雯琪.花椒挥发油抑菌作用研究［J］.食品科学，2009，30(21):128－130.

［5］ 赵媛.青花椒提取物对桃蚜和小菜蛾的生物活性研究［D］.石家庄:河北农业大学，2007.

［6］ 弭向辉.花椒挥发油的提取分离及其抗菌和抗肿瘤作用研究［D］.南京:南京师范大学，2004.

［7］ 石雪萍，关荣琴，张鸣镝，等.花椒属植物生物碱研究进展［J］.中国野生植物资源，2010，29(4):1－7.

［8］ 贝玉祥，董秀华，李干鹏，等.紫堇中总生物碱体外清除活性氧自由基及抗氧化作用研究［J］.食品科技，2008(4):189－191.

［9］ 江洁芳.花椒中抑菌活性成分提取工艺的研究［J］.中国调味品，2011，36(3):30－32.

［10］ 赵东亮，郁建平，周晓秋，等.博落回生物碱的抑菌作用研究［J］.食品科学2005，26(2):45－47.