牛粪浸出液培养微藻系统优化及含油率分析

丁爱军，梁 颖，贾明良，2，覃佐东，2，张本厚，陈集双，2*

(1.南京工业大学 大丰海洋产业研究院，江苏 大丰 224100;2.南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京210009)

随着全球经济的快速发展，能源的需求量日益增加且依存度不断提高，导致地球上化石能源储量日趋减少，为此寻找储量丰富且环境友好的绿色生物质能源代替化石能源将成为解决能源危机及可持续发展的途径之一［1］。近20年来，由动植物制备生物质柴油作为石油燃料的替代物，已引起世界各国的广泛关注。目前利用生物质资源生产柴油技术已经成熟，如玉米、植物秸杆、微藻及地沟油等。国内外利用微藻如小球藻、螺旋藻、栅藻等进行能源开发有相关研究，其中以小球藻的研究最多，它的光合作用效率是一般高等植物的10倍左右。小球藻以自养、异养、混合养等方式生长，目前已知的有十几种，包括变种在内，可达百种之多，具有分布广泛，生长速度快，易于培养及富含脂肪等特点［2］。自20世纪50年代以来，研究人员开始用微藻进行水处理研究，发现其具有降解水体有毒污染物、富集重金属离子等能力［3］。污水养藻是一种成本低廉、操作方便，易推广及有利于生态健康的技术，同时还可净化水体，是一种对环境减害化处理的同时获得有用能源物质的较好方法。异养培养小球藻可以克服自养培养的不足，是提高小球藻油脂含量的一条有效途径。本实验利用周边奶牛养殖场粪便作为材料，研究其浸出物对球藻生长和脂肪结累等影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验藻种 本实验小球藻种于南京工业大学开放式小球藻培养池中获取。

1.1.2 牛粪浸出培养基 牛粪取自上海光明集团大丰海丰奶牛场种植田边堆场，经烘干除臭处理，按50 g/L加入蒸馏水中，搅拌20 min，稍加热到80℃，400目过滤，静置12 h，收集上清液备用。蒸馏水与牛粪浸出液体积比设定为:9∶1、8∶2、6∶4、4∶6、2∶8、1∶9，并用 1 mol/L HCl或 NaOH 调 pH 为 6.5 ～6.8，设阳性BG11及阴性蒸馏水为对照组，培养基经121℃高温高压灭菌处理20 min。

1.1.3 主要仪器 BOXUN医用型超净台;L96G PCR仪、电泳系统及BioMate3S双光束紫外光/可见光光谱仪;美国Syngene凝胶成像系统;光学显微镜;UB-7 pH计;SIGMA台式高速冷冻离心机;XB-70制冰机及微量加样器等。

1.1.4 主要试剂 配制 BG11培养基试剂为 KNO3、K2HPO4、Ca(NO3)2、MgSO4、KCl、FeCl3、H3BO4、Zn-SO4·7H2O、MnSO4·H2O、(NH4)6MoO2·4H2O、CuSO4·5H2O 等，PCR 试剂为 DNA Marker、Taq 酶及MBI PCR产物纯化试剂盒;DNA及油脂提取试剂为丙酮、异丙醇、苯酚及甲醇等。

1.2 方法

1.2.1 球藻培养 采集的藻种用BG11培养液稀释后涂BG11固体平板，在25℃、光照周期为12 h:12 h、3 000 lx冷白荧光灯条件下培养。挑取单藻落平板上反复划线分离;将藻接种到含1 mL BG11培养基的PE管，同等条件培养20 d，镜检确认;接种至50 mL BG11中，每天定时摇动，OD680达0.3以上，取10 mL用于藻种鉴定;按牛粪浸出液培养实验设计要求，每实验组接种1 mL藻种，培养4周，每周取样3 mL，用于生长量测定，剩余用于藻类油脂提取。

1.2.2 18S rDNA序列分析 采用18S rDNA鉴定的方法确定经分离纯化球藻的种属。总DNA的提取采用CTAB法，Invitrogen公司提供并合成的PCR扩增上下浮引物，分别为18S－F:5'GCGCGGCTCATTAAATCAGTTATAG3'18S－R:5'，CCCTTGTTACGATTTCTCCTTCCTC3'，PCR 反应条件为 94℃ 变性3 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，35个循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物再进行纯化并测序。18S rDNA序列在GenBank进行BLAST序列比对对藻种鉴定。

1.2.3 球藻及牛粪浸出液吸光度扫描 取1.5 mL藻液3 500 r/min、5 min离心，弃上清液，在沉淀中加入2.5 mL丙酮充分溶解，提取球藻中叶绿素，在BioMate 3S双光束紫外光/可见光光谱仪上扫描其在300～800 nm吸光值，确定球藻生长量测量时所采用的波长。牛粪浸出液用蒸馏水作基线，将其按1∶9稀释，在200～900 nm内进行扫描，确定其波长。

1.2.4 球藻生长速率测定 根据扫描结果，确定小球藻叶绿素有2个吸收峰，分别为波长660 nm和430 nm。每周收集1次样品，测定其在2个波长的吸光值，根据公式统计各实验组叶绿素A、叶绿素B及叶绿素总量的日均增长率等，球藻总叶绿素值 =OD660×8.02+OD430×20.21［4］。

1.2.5 球藻油脂提取 收集等量藻液，5 000 r/min、3 min离心，再用ddH2O洗涤2次，离心烘干称重;经两次－20℃ ～40℃冻融，加入5 mL的氯仿∶甲醇 (1∶2)溶剂萃取充分，加石油醚3 mL，60℃水浴60 min，离心过滤，水浴蒸发，105℃烘干冷却后称重，每组重复3次，数据统计，单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 18S rDNA 序列分析

经纯化后采用CATB法提取小球藻全基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测质量合格(图1);利用基因组 DNA及上下游引物进行PCR扩增，18S rDNA基因片段约为1.7 kb(图2);经PCR产物纯化试剂盒纯化，并送上海生工进行测序，通过双向测序，利用软件进行序列拼接，最终获得长度约为1.7 kb的球藻18S rDNA基因序列。通过BLAST程序获得NCBI的GenBank数据库18S rRNA基因与球藻相近的序列，确定比对结果，证明该小球藻属于普通小球藻株。

图1 小球藻基因组DNAFig.1 Chlorella vulgaris genome DNA

图2 小球藻18S rDNA PCR产物Fig.2 Chlorella vulgaris 18S rDNA PCR product

2.2 牛粪浸出液培养球藻生长率测定

2.2.1 球藻和牛粪浸出液吸光度扫描 用丙酮提取的小球藻叶绿素在双光束光度仪上波长扫描，发现球藻叶绿素在可见光范围内有2个明显吸收峰，分别在660 nm和430 nm(图3)，根据扫描结果可以用660 nm和430 nm作为叶绿素吸光度的测定波长。利用蒸馏水为空白作基线，牛粪浸出液经扫描吸收峰位于200～350 nm，400～900 nm其峰值明显降低，接近于0(图4)，可知，牛粪浸出液培养球藻利用双光束光度仪测定叶绿素吸光值不受干扰，且数据稳定可靠。

图3 球藻叶绿素光谱扫描Fig.3 Spectral scan on chlorophyll of Chlorella vulgaris

图4 牛粪浸出液光谱扫描Fig.4 Spectral scan on extracts from cow dung

2.2.2 球藻培养生长率测定 利用牛粪浸出液培养球藻，共设6个试验组，2个对照组，每周取样1次，共取4次，利用双光束光度仪在660 nm和430 nm 2个波长测定叶绿素吸光值，并分别记录，根据公式计算球藻叶绿素总量，确定其生长率，结果见图5。由此可见，利用牛粪浸出液进行球藻养殖其生长速度高于BG11培养剂，且差异明显，同时发现高浓度牛粪浸出液抑制球藻生长，随着其营养消耗浓度降低，球藻生长速度逐渐提高，这可能与球藻生长对有机物利用控制调节有关。球藻培养最适水与牛粪浸出液体积比为4∶6，培养周期为20 d左右。结果表明利用牛粪浸出液进行藻类培养是可行的。

2.3 异养球藻油脂含量测定

每个试验组收集等量藻液，设3个平行组，经洗涤、萃取及烘干等处理，称重并记录数据，通过单因素方差分析，其结果见图6。结果表明，利用牛粪浸出液培养球藻油脂含量明显高于BG11对照组，差异显著(P ＜0.05);试验组(2∶8)、(1∶9)球藻后期生长量大，观察呈丝状而且相互粘在一起，可能导致萃取不充分，使得油脂提取得率下降;而试验组(9∶1)、(8∶2)和(6∶4)球藻后期生长未出现上述现象，萃取充分，其油脂得率逐步升高，达0.57以上。利用与BG11培养的球藻相比，观察发现牛粪浸出液培养的球藻呈深绿色，可以说明牛粪浸出液能提高球藻油脂得率，研究发现最佳适合球藻培养体积比为4∶6。这可能与球藻吸附培养液的脂肪有关。

图5 牛粪浸出液培养球藻生长率曲线Fig.5 Growth rate curve of Chlorella vulgaris cultured by extracts from cow dung

图6 各试验组球藻提取油脂得率Fig.6 Lipid content graph extracted from Chlorella vulgaris in each test group

3 讨论

微藻生物研究属于生命科学研究领域的一个重要分支，是目前国内外研究的热点。小球藻是人类最早分离培养的一种绿藻，其生态分布广，适应性强且油脂含量较高，它的生长速度快，光合作用效率是一般高等植物的10倍左右。另外，小球藻在不同培养条件下可以产生10% ～30%细胞干重的脂类，可以用于转化为脂肪酸甲脂即生产生物柴油，是目前研究生产生物柴油的热点藻种之一［5－6］。本实验藻种18S rDNA序列利用 BLAST程序分析表明球藻种18S rDNA基因序列与 Chlorella vulgaris sp.NIE21721最为接近，且仅有一个碱基替换，与另一种小球藻Chlorella vulgaris sp.CCAP260/11属同一个分支，进一步可以确证他们之间存在很近的亲缘关系，从而可以确定实验藻种属于普通小球藻。

自1953年Lewin等［7］首先发现了某些种类能利用有机物作为唯一碳源和能源进行异养生长以来，受到科学界广泛重视。有研究表明，小球藻在只有无机盐、维生素以及光作用的条件下就能正常生长，且光合效率高。但无机盐培育的小球藻，由于营养盐迅速消耗以及各种影响因素的干扰，在生产中极不稳定。近年诸多研究者对小球藻异养的研究开始关注，当在培养液或培养基中含有葡萄糖等有机碳源时，小球藻的营养方式可以由自养转变为异养。高密度培养方式可以使小球藻的生长速度、密度细胞大幅度提高，而不受光限制［8］。异养条件下，小球藻细胞内油脂含量可达60%以上，可作为一种新型的油脂资源［1，9］。目前，国内外对牛粪进行了很多研究，证明牛粪具有广泛的用途，如利用牛粪生产再生饲料、生产沼气、发电及在木屑栽培平菇中的应用等［10］。对实验原料牛粪进行的生化分析和研究中得出，在新鲜牛粪便中，水占83.2% ～83.36%，有机物占8.44% ～10.62%，灰分占5.2% ～6.18%，其中有机物成分主要为未消化的纤维素和蛋白质(水溶性蛋白质含量1.17% ～1.23%)等，pH值为7.5［11］。牛粪还有另外一些用途，其浸出液敷于小白鼠伤口，可促进其愈合效果［10］。可探索利用牛粪为材料及发酵工程的方法大规模地生产微藻，为微藻内含物、生长及吸附等机理的研究提供基础平台。

大多数产油微藻的油脂组成与油料植物相似，脂肪酸多以C16和C18为主［12］，且多为饱和和单不饱和脂肪酸，小球藻也不例外［13］。本实验利用牛粪浸出物培养球藻油脂得率高于BG11培养方式，可能是浸出物中多糖、脂类等经过次生代谢将脂类物质贮藏于液泡或细胞壁中，或通过吸附功能［14］将浸出液中的脂肪吸附细胞表面，也可能是缺N等环境胁迫等因素［15］，从而提高油脂含量，相关机理研究需要进一步研究证实。

本研究中主要优化了牛粪浸出液培养微藻系统和产油率方面的关系，进一步可对牛粪浸出物中的有机物及N、P成分的含量进行测定，同时分析球藻脂肪组成，以探讨球藻脂肪生成代谢调控，为提高球藻产油提供有力证据。

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