肉牛附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用

许兰娇，陶清松，黄志海，，瞿明仁，何后军，万 根*

(1.江西农业大学 动物科技学院，江西 南昌 330045;2.江西省宜春市畜牧科学研究所，江西 宜春 336000)

肉牛附红细胞体病是由温氏附红细胞体(Eperythrozoon wenyonii)寄生于肉牛红细胞表面、血浆及骨髓等部位引起的一种人畜共患传染病，临床表现以发热、贫血、黄疸为主。自 Schiling等［1］首次报道附红细胞体病以来，该病已遍布了30多个国家和地区，目前中国大部分的地区都有动物感染该病的报道［2］。

肉牛附红细胞体病的发生与饲养管理、饲养密度、栏舍空气质量、环境变化、气候变化等密切相关，多数情况下，温氏附红细胞体侵入机体呈隐性状态，任何因素引起机体抵抗力下降时，都会导致该病的发生［3］。近年来，中国肉牛产业在国家政策的指导下发展迅速，规模养牛场迅速增多，该病的报道也逐渐增多，如何防控人畜共患病的发生，促进肉牛产业的健康发展和消费者的放心消费，对肉牛附红细胞体病进行及时准确的监测是非常必要的。

目前，对附红细胞体的临床检测仍然以镜检法为主，快速简单，但是这种方法的缺点是特异性和敏感性低［4］，容易引起假阳性和假阴性［5］，导致临床诊断失败，附红细胞体ELISA检测试剂盒处于研发过程中，DNA探针技术、电镜检测等因试验条件或费用昂贵等都不适合与临床疾病诊断［6］。本试验通过建立一个简单、快速、特异性好、敏感度高的肉牛附红细胞体PCR检测方法，对该病原的检测做出快速准确的判断，有利于临床上及时做出准确的诊断。

1 材料与方法

1.1 临床病料与处理

肉牛附红细胞体DNA由江西省动物疫病预防控制中心提供，阳性病料为江西省的某规模肉牛养殖厂无菌采集的5份附红细胞体阳性血液样品，加38 g/L的枸橼酸钠溶液抗凝，低温运送至实验室－80℃保存。

1.2 分子生物试剂

DNA PCR扩增试剂盒，饱和酚、胃蛋白酶K、EB等购自大连宝生物公司，氯仿、无水乙醇、异戊醇、醋酸钠等化学试剂均为分析纯试剂，购自于江西碧源生物科技有限公司，DNA Marker DL1000购自大连宝生物公司。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank中已发表的肉牛温氏附红细胞体的16S rRNA基因序列(序列号:AY946266)，同时参考有关文献，利用计算机辅助软件primer 5.0设计一对特异性PCR引物，预计扩增片段长为412 bp。引物序列如下:

上游引物P1:5'－GATGGAGATCGCCTCCCTAG －3'

下游引物P2:5'－GCACCACCTGTCTTACTGATT －3'

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，稀释成浓度为20 μmol/L，－20℃分装保存备用。

1.4 DNA 的提取

按照试剂盒操作说明提取肉牛附红细胞体 DNA，加入20μL灭菌双蒸水或TE溶液溶解，－20℃保存备用或立即使用。

1.5 PCR反应体系及反应条件

PCR 反应总体积为25 μL，组成如下:10 × PCR buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，dNTP mixture 0.5 μL，DNA 模板 2 μL，上游引物(P1)、下游引物(P2)各1 μL，Taq 酶0.5μL，双蒸水16μL，将各组分混匀后进入PCR循环。扩增基因片段的参数设置为:94℃预变性3 min;94℃变性58 s，58℃退火45 s，72℃延伸40 s，30个循环;最后72℃再延伸10 min，反应在基因扩增仪(PE9700)上进行。反应结束后将PCR产物，4℃保存。

图1 PCR扩增结果Fig.1 The amplified results by PCR

图2 特异性试验PCR扩增结果Fig.2 The amplified results by PCR in Specific Test

图3 敏感性试验PCR扩增结果Fig.3 The amplified results by PCR in Sensitivity Test

2 结果分析

2.1 检测结果

取10 μL PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察，可见用优化后的PCR方法扩增出了412 bp的核酸条带，结果如图1。

2.2 扩增片段的特异性鉴定

对PCR扩增产物纯化后进行测序，基因序列全长为412 bp，并对其序列进行同源性分析，与Genbank中温氏附红细胞体(序列号:FJ375309)的同源性为98%以上。提取牛大肠杆菌、弓形体、胸膜肺炎放线杆菌DNA，用所设计的引物进行扩增，显示为阴性(图2)，说明扩增产物具有良好的特异性，用本试验建立的方法进行临床组织病料中附红细胞体的检测是可行的。

2.3 敏感性试验

用紫外分光光度计测定稀释后的DNA的浓度为123 ng/μL，进行10倍的连续稀释，用上述PCR方法扩增，结果显示该PCR方法可以检测的最低DNA浓度为1.23 ng/μL(图3)。

3 讨论

(1)肉牛附红细胞体病是一种人畜共患病，它不仅危害动物的健康，引起动物发生疾病和死亡，给养殖业带来巨大经济损失，而且严重危害人类的健康。附红细胞体的传播途径多，可通过血液昆虫(如:蚊子、苍蝇、蜱等)、伤口、注射器等感染动物和人［7］。近年来，人感染附红细胞体的报道不断增多，并呈现上升的趋势，已引起医学界和畜牧工作者的高度关注［8－12］。由于诊断方法的局限性，一些流行病学特点难以观察和掌握，因此用分子生物学技术对肉牛附红细胞体病进行快速准确检测，对提高该病诊断的准确性具有重大意义。

(2)中国肉牛产业正处于一个蓬勃发展阶段，对肉牛各种流行疾病做出快速准确的判断，有利于产业的良好发展。目前国内对附红细胞体的诊断方法主要以镜检法和血涂片法为主，而该方法在操作过程中常常会引起红细胞的变形而导致误诊［13－14］。本试验建立的肉牛附红细胞体PCR检测方法的扩增产物序列与Genbank中公布的牛温氏附红细胞体的序列比较，同源性98%;通过提取牛大肠杆菌、弓形体、胸膜肺炎放线杆菌的DNA并进行扩增，结果均为阴性;能够检测的最低DNA浓度为1.23 ng/μL。说明本试验所建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性。通过对阳性血样的检测，结果准确性良好，表明所建立的PCR方法在临床上对肉牛附红细胞体病能做出快速准确的判断。

(3)国外研究人员对附红细胞体分子生物学方面的研究较早［15］。国内关于牛附红细胞体分子生物学方面的研究近年来也有报道，重点倾向于牛附红细胞体的鉴定归类［16］，肉牛附红细胞体病原的PCR检测方法未见报道。当前，中国肉牛产业处于快速发展时期，做好肉牛的人畜共患病的监测与防控，为市场提供安全放心牛肉具有重大意义。本试验建立的肉牛附红细胞体PCR检测方法操作简单快速、特异性好、敏感度高，8 h之内可得出结果，克服了以往方法的缺点，为该人畜共患病的临床监测和诊断提供了新的分子生物学诊断技术，也符合当前人畜共患病快速诊断的需求，同时也极大地丰富了附红细胞体的流行病学及兽医临床诊断学等方面的知识内容。

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