人脂肪干细胞复合Ⅰ型胶原支架材料构建脂肪组织的实验研究

钟振东，傅 荣，游晓波，鲁 峰

(1.四川省医学院科学院·四川省人民医院a.实验动物研究所，b.整形外科，四川 成都 610072;2.南方医科大学南方医院整形外科，广东 广州 510515)

虽然组织工程已经发展了近20年［1，2］，许多工程化组织和器官已经出现在生物医学领域，有些已经用于临床。然而，应用脂肪细胞组织工程技术修复软组织缺损近期才引起学者们的关注［3～5］。虽然脂肪组织工程的方案还未到能够应用于临床阶段，但是已经有体内研究的证据［6～9］。2010～2012年四川省医学院科学院·四川省人民医院与南方医科大学南方医院通过将细胞和Ⅰ型胶原支架材料复合培养，移植裸鼠皮下，探讨构建工程化脂肪组织的适宜方法，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物:42只出生4～6周的裸鼠(品系为BALB/c，体重18～23 g)。主要仪器:CO2培养箱(Heraeus，德国);液氮罐(CBS，美国);离心机(Heraeus，德国);倒置相差显微镜(Olympus，日本)。主要试剂:DMEM、胎牛血清由 Gibco公司生产;I型胶原酶、胰蛋白酶、I型胶原支架材料、四氮唑复合物(XTT)，硫酸酚嗪甲酯和二甲基亚砜均购自 Sigma，12孔细胞培养板购自 Corning。

1.2 脂肪组织来源的脂肪干细胞(ADSCS) 原代、传代培养取人吸脂术中吸出的脂质部分，用缓冲液反复冲洗，剪刀剪碎。0.1%胶原酶37℃消化40 min，期间需反复震荡混匀1次，使用等量体积的完全培养基中和后，离心1200 g×5 min，去上清，沉淀混悬后使用肽盼蓝染色检测细胞活性，加入10%DMEM培养基中，37℃5%CO2孵箱培养过夜。待细胞生长融合达80%即可传代，取第3～4代细胞供实验用。

1.3 细胞-支架复合物的形成 将胶原蛋白支架材料裁制成10 mm×10 mm×1 mm大小，利用紫外线照射及酒精浸泡消毒，培养液平衡后待用。培养的脂肪干细胞消化后制成细胞悬液，细胞密度为2×105/ml，表面种植0.2 ml细胞悬液，静置4 h后，加入含20%胎牛血清的 DMEM培养液，37℃、5%CO2培养箱中培养5 d。

1.4 细胞-支架复合物移植 取4～6周龄大裸鼠，氯氨酮麻醉，常规消毒铺巾。无菌条件下在其背部中线两侧皮下，对称钝性分离出2个潜腔，分别植入ASCs+材料(左侧)和空白材料(右侧)。无菌丝线缝合皮肤。

1.5 组织工程新生物大体观察和生物学检测 移植后12周处死动物，将新生组织取出，给予大体观察和湿重测定。组织工程新生物常规冰冻切片，倒置显微镜，激光共聚焦显微镜，扫描电镜观察。

2 结果

2.1 大体观察 所有裸鼠术后均活动如常，植入处表面皮肤完整、光滑，无炎症反应，植入物无脱出，无免疫排斥反应，无死亡。

2.2 组织工程新生物大体观察和湿重测定 于移植后12周处死动物，取出材料进行大体观察。从复合细胞的支架材料侧获取了约黄豆大小(约4 mm×4 mm×2 mm)的脂肪样新生组织，空白支架对照侧未见新生组织块。对新生物进行了湿重测定，新生组织平均湿重0.019 g，见图1。

图1 新生物取材 a:实验侧新生组织;b:对照侧(空白支架)无肉眼可见新生组织块;c:新生物大体测量及湿重测定

2.3 组织学检测 新生组织的HE染色观察发现其组织结构与正常脂肪组织相似(图2a)且油红0染色阳性(图2b)，证明新生组织为脂肪组织。

3 讨论

组织工程学的研究主要集中在生物可降解支架材料、种子细胞、体外培养条件等方面，其中理想的三维支架的构建是组织工程化人工器官、组织研究成功的前提条件［9，10］。细胞与支架材料的相互作用是组织工程所需要考虑的关键问题之一，胶原蛋白是目前组织工程学研究中最常用的天然生物材料，由多种糖蛋白分子组成，占机体总蛋白的 30%(85%为I型胶原蛋白)，它具有多方面的生物活性，不仅是组织支持物，而且是细胞外间质的重要成分［11，12］。研究表明，胶原蛋白生物相容性好，降解速度可调，而且可参与组织修复，是优良的可引导组织再生的生物材料［13，14］。Ⅰ型胶原作为体外细胞培养支架时，有促进细胞粘附和诱导生长分化的作用，是良好的培养粘附剂［15，16］。故本实验选择胶原蛋白支架作为研究对象。

图2 新生物组织学检测a:HE染色见正常脂肪组织样结构(×10);b:油红0染色阳性，证实其含脂质成分

我们在研究中发现，将成脂诱导后的脂肪干细胞与Ⅰ型胶原支架复合体外混合培养，植入裸鼠皮下培植12周后，形成了黄豆大小的脂肪样组织，经组织切片、油红0染色等观察证实为具有成熟结构脂肪功能的脂肪组织，而对照侧(空白支架)未形成脂肪组织。研究显示，ASCs作为种子细胞的确可以应用于脂肪组织的组织工程研究，并且能合成具有三维结构及功能完整的脂肪组织［17］。另外，I型胶原支架是优良的组织工程生物载体，其良好的生物相容性，对修复大范围的软组织缺损尤为理想［18，19］。

虽然本研究为今后的脂肪组织工程研究提供了一种可行的方案，但关于细胞培养，生物力学，细胞分化，新生血管，计算机模拟，支架生化特性等诸多方面仍需要大量细致的研究，才有可能将这项技术最终应用于临床患者。

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